γ射线对小鼠胸腺淋巴细胞微丝形态及丝切蛋白磷酸化的影响

齐雪松，王春燕，李 辰 ，佟 鹏，邵 帅，曲功霖，苟 巧 ，苏 旭*

（中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所，辐射防护与核应急中国疾病预防控制中心重点实验室，北京 100088）

细胞微丝对细胞生物学各个方面都有影响，参与细胞的运动、物质运输、能量转换、信息传递、细胞分化等一系列重要功能[1]。丝切蛋白(cofilin)可促进微丝解离，抑制单体肌动蛋白聚合，最终引起微丝骨架改变[2]。在哺乳动物细胞中存在3种丝切蛋白家族成员，即肌动蛋白聚合因子(actin depolymerizing factor，ADF)、cofilin 1和cofilin 2。其中ADF和cofilin 1主要存在于非肌肉细胞中，cofilin 2主要存在于肌肉细胞中，cofilin 1比ADF在肌动蛋白成核过程和剪切过程起着更重要的作用[3]。cofilin 1蛋白广泛存在于静息细胞的胞质中，一旦细胞活化，它会出现在细胞膜运动的边缘，参与微丝骨架的高速组装和细胞移动[4]。cofilin 1在机体组织中的表达水平不尽相同，在神经系统、肠道、肾脏和睾丸中表达较高，在造血组织、破骨细胞和成纤维细胞中也有较高表达[5-6]。有研究报道，cofilin 1在胃癌细胞中过表达，促进细胞骨架重排，诱导上皮间质转化[7]。下调LIMK1-ADF/cofilin可抑制结肠癌的转移和侵袭[8]。当γ射线诱导小鼠胸腺淋巴细胞时发现微丝随照射剂量增大而损伤加重，cofilin基因表达随照射剂量的增大而上调[9]。这些结果表明cofilin的表达变化对细胞的功能状态发挥着重要调节作用。

淋巴细胞是机体免疫系统的主要参与者，同时具有较高辐射敏感性，大剂量电离辐射时，外周血淋巴细胞的急性损伤严重，是医疗救治的难点。因此，本项目拟通过观察γ射线诱导BALB/c小鼠胸腺淋巴细胞的微丝形态变化和对cofilin蛋白磷酸化的影响，探讨cofilin及相关蛋白在辐射损伤中的作用，为临床救治提供实验依据及探索新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级BALB/c小鼠，60只，雄性，4～6周龄(北京维通利华)，实验动物许可证号SCXK(京)2011-0039。SPF级动物房饲养，自由饮水，观察无异常后进行实验。将36只小鼠随机分为6组，分别为对照组(0 h组)、照后3、6、9、12和24 h组，除对照组外，其他组给予2 Gy γ射线照射，于照后各时间点颈椎脱臼处死小鼠，解剖取出胸腺，用吸满0.01 mol/L PBS溶液的1 mL注射器(美国BD公司)将胸腺中的淋巴细胞冲出，离心收集细胞。通过cofilin基因mRNA和蛋白的表达检测，确定适宜的取材时间。再将另24只小鼠随机分为4组，分别为未照射(0 Gy)组、2、6和10 Gy组，除未照射组外，其他组给予不同剂量的γ射线照射，于前述确定的适宜时间取材，进行cofilin蛋白、磷酸化cofilin蛋白(phosphorylated cofilin，p-cofilin)、LIM激酶1 (LIM domain kinase 1，LIMK1)、TES激酶2(testicular protein kinase 2，TESK2)和Slingshot家族的磷酸酶2 (slingshot phosephatase 2，SSH2)蛋白表达检测。

1.2 照射条件

分别将小鼠装进照射盒内，剂量率为0.3 Gy/min，60Co γ射 线 (新 华 FCC-7000A)全 身 一 次 均 匀 照 射 ， 2 Gy照射时间约为400 s，6 Gy照射时间约为1 200 s，10 Gy照射时间约为2 000 s。

1.3 荧光双标法观察微丝形态

用4%多聚甲醛(美国Sigma Aldrich公司)固定收集的小鼠胸腺淋巴细胞，加入300 μL 0.2% Triton-X 100，室温静置5 min，离心弃上清。加入200 μL 0.5% BSA，室温静置10 min，离心弃上清。加入FITC-鬼笔环肽(Phalloidin，美国Sigma Aldrich公司，针对actin微丝蛋白)和Alex Fluor 594连接的脱氧核糖核酸酶I (美国Invitrogen公司)，终浓度均为5 μg/mL，混匀、孵育，离心弃上清。用0.01 mol/L PBS 1 mL清洗2次，调整细胞浓度约为104～ 105/mL。混匀，取10 μL细胞悬液滴片，并用含有DAPI的抗荧光淬灭剂(美国Vector公司)封片。激光共聚焦显微镜观察胸腺细胞微丝的形态变化。

1.4 采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)检测cofilin mRNA的表达水平

Trizol法提取小鼠胸腺淋巴细胞总RNA，取1 μL总RNA原液，用紫外可见分光光度计NANODROP 2000(美国Thermo Fisher公司)直接检测，读取D(260)/D(280)比值和浓度值，各组总RNA D(260)/D(280)值在1.78～2.02范围内，符合实验要求。以各组总RNA为模板，按GoScript反转录体系(美国Promega公司)说明书进行cDNA合成。以GAPDH为内参基因，cofilin为目的基因，SYBR染料法(美国Invitrogen公司)检测小鼠胸腺细胞中cofilin mRNA表达水平。

1.5 Western blot检测蛋白表达

取经BCA法定量的蛋白样品25 μg，与5×蛋白上样缓冲液(上海生工)混匀，置于沸水中加热5 min，使蛋白质变性。迅速放入冰中冷却，离心后SDSPAGE电 泳 ， PVDF膜 (美 国 Millipore公 司 )转 膜 ， 5%

B

SA封 闭 (上 海 生 工 )， 分 别 用 cofilin、 p-cofilin、LIMK1、TEST2、SSH2和GAPDH一抗孵育，4 ℃过夜，二抗孵育，室温1 h(抗体均购自美国CST公司)，滴加发光液(美国Santa Cruze公司)，用ChemiDoc XRC+成像系统(美国Bio-Rad 公司)拍摄条带图像。

1.6 数据处理与分析

用2-ΔΔCT法对qPCR结果进行相对定量分析，用成像分析系统测量Western blot条带的灰度值，内参蛋白为GAPDH，将目的蛋白与内参蛋白进行灰度值对比校正，得到蛋白的相对表达量。用SAS 9.0软件进行数据统计，数据进行方差齐性检验，方差齐的数据进行方差检验，方差不齐的数据进行秩和检验。

2 结果

2.1 γ射线诱导小鼠胸腺淋巴细胞不同时间cofilin基因表达的变化

由于2-ΔΔCT法要求目的基因与内参基因的扩增效率一致，因此根据cDNA浓度梯度的log值(X)和ΔCT值 (Y)，求出两者的线性关系，Y=8.2+0.092X，斜率为0.092，接近于0，说明cofilin基因与GAPDH基因扩增效率一致，可用2-ΔΔCT法对cofilin基因mRNA表达的进行相对定量分析。

经方差齐性检验，各组数据方差齐(F=2.40、1.67、0.12，P＞0.05)，可用于方差分析。图1A可见，与对照组(0 h组)比较，cofilin基因mRNA表达在照后24 h内，除12 h组外，其余各时间组均呈明显的下调趋势(P＜0.05)。cofilin蛋白表达在照后3和9 h组呈明显降低(t=2.58、3.04，P＜0.05)，其他组变化并不明显，见图1C。p-cofilin蛋白表达变化趋势与cofilin蛋白相似，但与0 h组比较各组差异均无统计学意义(P＞0.05)。考虑cofilin基因表达在照后3 h明显下调，且为最早出现变化的时间点，因此选择照后3 h为后续实验取材时间。

图1 2 Gy γ射线诱导小鼠胸腺淋巴细胞24 h内的cofilin基因表达和p-cofilin蛋白表达变化

2.2 不同剂量γ射线诱导小鼠胸腺淋巴细胞微丝形态的变化

激光共聚焦显微镜下观察，未照射的胸腺淋巴细胞质纤维形肌动蛋白(fibrous actin，F-actin，绿色标记)清晰可见、排列紧密、形态完整、边缘光滑、颜色明亮、球形肌动蛋白 (globular actin，G-actin，红色标记)弥散且均匀分布于胞质中，细胞核(蓝色标记)颜色较淡。2、6和10 Gy γ射线诱导后3 h，细胞的F-actin含量随照射剂量增大而逐渐减少，细胞核明显，有的细胞中可见F-actin疏松的丝状排列或断裂的F-actin小体。G-actin分布不均匀，呈团块状聚集(图2)。

2.3 不同剂量γ射线诱导BALB/c小鼠胸腺淋巴细胞cofilin和p-cofilin蛋白表达的变化

2、6和10 Gy γ射线诱导3 h后取材，与0 Gy组比较，发现随着照射剂量的增加，各照射组cofilin蛋白表达量逐渐上调，其中10 Gy组上调差异有统计学意义(P＜0.05)，而p-cofilin的表达随射线剂量的增加而下调，其中10 Gy组下调有统计学意义(P＜0.05)(图3)。这表明，随着照射剂量的增加，p-cofilin蛋白表达量减少，cofilin蛋白表达量增高，引起F-actin快速解聚，抑制G-actin的聚合，淋巴细胞的迁移能力增强。

图2 不同剂量γ射线诱导小鼠胸腺淋巴细胞微丝形态的变化

2.4 不同剂量γ射线对cofilin磷酸化酶和去磷酸化酶表达的影响

如图4所示，磷酸化酶LIMK1蛋白和TESK2蛋白表达随γ射线剂量增大而小幅下调。去磷酸酶SSH2蛋白的表达随γ射线剂量增大而增高，但差异均无统计学意义(P＞0.05)。

图4 不同剂量γ射线诱导胸腺淋巴细胞cofilin磷酸化酶和去磷酸化酶蛋白表达的变化

3 讨论

cofilin蛋白的活性主要由其Ser3位点磷酸化与否进行调控，LIMK和TESK为主要的磷酸化酶，使Ser3位点磷酸化，cofilin蛋白失活，不能与肌动蛋白丝结合，提高了F-actin的稳定性；SSH为主要的去磷酸化酶，使Ser3位点去磷酸化，激活cofilin蛋白，使其能够与F-actin结合，促进肌动蛋白丝的解聚[10]。由此可见，cofilin的磷酸化进程是肌动蛋白解聚的开关。cofilin可结合G-actin，参与去组装过程，是去组装过程中不可或缺的蛋白，但磷酸化的cofilin与G-actin的亲和性显著降低[11]。对人结肠癌发生进程的研究发现，LIMK/cofilin通路上的LIMK1、LIMK2和SSH2的过表达与结肠癌的进程及其化学抗药性相关，并有望成为结肠癌治疗中的肿瘤标志物和治疗靶标[12]。在脑型疟疾研究中发现，LIMK1/cofilin1通路的失调，使得神经细胞的树突形态发生改变，形成了actin-cofilin小体[13]。这些研究显示了LIMK/cofilin通路在疾病研究中的重要性，但在电离辐射诱导的损伤机制研究中相关的报道并不多见。

本研究检测了γ射线诱导BALB/c小鼠胸腺淋巴细胞cofilin 1、p-cofilin、LIMK1、TESK2和SSH2蛋白表达的变化，发现随着照射剂量的增加，cofilin 1的表达有增加的趋势，而p-cofilin的表达则减少，磷酸化酶LIMK1和TESK2的表达小幅下调，但去磷酸化酶SSH2的表达呈上调趋势，因此可推测，随着照射剂量的增加，更多的SSH2使p-cofilin的Ser3位点去磷酸化，这使得细胞质中cofilin 1的含量增多，参与到微丝骨架组装的过程中，并能使淋巴细胞进入活跃状态，其迁移能力增强，行使各项功能，以增强对射线的抵抗能力。但2 Gy γ射线诱导，随着时间的延长，cofilin 1 和p-cofilin的含量均减少，这可能是细胞内贮存的pcofilin受损或消耗过多，cofilin 1供应不足，淋巴细胞的活化能力降低，辐射敏感性增强。当上调脑胶质瘤细胞U251的cofilin蛋白表达，U251的辐射抗性显著增强，下调cofilin蛋白表达后，U251的迁移能力和辐射抗性均降低[14]。肝癌细胞也有类似的表现，当pcofilin表达的增多可以使肝癌细胞的迁移能力降低[15]。Jurkat T细胞的研究中发现SSH基因沉默会降低细胞的迁移和活化[16]。

放射治疗中的免疫细胞降低一直是影响疗效的首要副作用[17]，其产生的机制并未探明。虽然已有一些防治措施，但疗效未达预期。从微丝的角度探讨免疫细胞辐射敏感的机制研究正逐渐成为热点，并具有潜在的临床应用价值。本研究对电离辐射诱导微丝改变的机制进行了初步摸索，发现了一些变化规律，提出假设，进一步验证工作亟待深入。