新疆地锦草提取物体外抗氧化及抑菌活性研究

热子亚·麦麦吐逊， 努斯热提古丽·安外尔， 祖丽皮亚·玉努斯

(新疆大学生命科学与技术学院， 新疆 乌鲁木齐 830046)

地锦草为大戟科植物地锦(EuphorbiahumifusaWilld.)或半地锦(EuphorbiamaculateL.)的干燥全草，广泛分布于亚洲东部，是常用的中药材，其性味归经:辛、平，入肝、大肠经，具有清热解毒、凉血止血、利湿退黄功效，可用于治疗痢疾、泄泻、咯血、尿血，便血、崩漏、疮疖痈肿、湿热黄疽等，引起了医学领域的高度重视。主要化学成分有黄酮类、酚酸类，其鲜汁、水煎剂、醇提液均有抗菌作用。有研究表明，地锦草有很强的抑制和清除自由基的作用，是一个较强的抗氧化植物[1]。

近几年来,人们对地锦草化合物含量测定、成分分析及其生物学活性的研究取得了很大进展[2]。有文献报道，地锦草提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌[3],沙门菌和巴氏杆菌[4]等均有明显的抑制作用。有小鼠灌服地锦草提取物，可明显增加小鼠的抗氧化能力的研究报告，但针对地锦草提取物体外抗氧化方面的研究较少。本试验针对新疆地锦草醇、水两种提取物的体外抗氧化能力及对4种致病菌的抑菌活性进行了研究，为新疆地锦草的进一步开发提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂 地锦草(新疆和田)；试剂：邻二氮菲、硫酸亚铁、三氯化铁、2，2-二苯基-1-苦味酰基自由基(DPPH)等，购自沈阳化学试剂厂，化学试剂均为分析纯。培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；供试菌株：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌由新疆大学生命科学与技术学院微生物教研室提供。

仪器与设备：洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；电子天平 (北京赛多利斯天平有限公司)；可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)；BCD-216TX型冰箱 (青岛海尔股份有限公司)；HH-W型三用恒温水箱 (江苏省金坛市医疗仪器厂)；RE-52旋转式蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂) ；DXF200植物粉碎机 (中山市东凤镇安密尔电器厂)。

1.2 试验方法

1.2.1 地锦草提取物的制备[5-6]地锦草醇提物，称取已烘干后粉碎的地锦草10 g，用70%乙醇溶液(1∶15)采用超声法进行提取1 h，提取3次，真空抽滤，对滤液进行减压浓缩得浓缩液用干燥箱烘干(45 ℃～50 ℃)后储存备用。

地锦草水提物:跟上述一样地锦草料水比为(g/mL)1∶15、温度为100 ℃、浸提时间为 2 h、重复 3 次，储存备用。

1.2.2 抗氧化试验

1.2.2.1 母液的制备 称取 0.1 g提取物浓缩物放着100 mL容量瓶水溶解并定容，作为母液。称0.1 g 维生素C 用蒸馏水定容100 mL(1 mg/mL)作为维生素C母液，置于冰箱中备用。

1.2.2.2 还原力的测定 按王晓梅，徐秋萍等[7]方法测定醇提物的还原力，并测定在最大吸收波长处的吸光值。

1.2.2.3 羟基自由基清除率的测定 按努尔阿丽耶·阿卜力米提等[8]的方法将把已准备好的母液分别置于6个试管中，并用蒸馏水候补。依次加入10 mmoL/L FeSO4溶液1 mL，10 mmoL/L的水杨酸-乙醇溶液加入1.00 mL，8.8 mmoL/L的H2O2溶液加1 mL，室温反应30 min，在最大吸收波长处测定吸光值。羟基自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%。式中A0-不加提取物的吸光值，A1-测定液的吸光值，A2-提取物本身的吸光值。

1.2.2.4 DPPH·自由基清除试验[9]按1.2.2.3方法一样，分别6个试管，每个试管中分别加入1 mL， 2×10-4mol/L的DPPH·溶液，充分混合均匀，室温避光反应0.5 h，在最大吸收波长处测定吸光值A，重复3次。并以稀释10倍的维生素C为阳性对照，操作同上，每个样重复测定3次。DPPH:自由基清除率(%)=[1-(A-A1)/A0]×100% 。式中:A0-提取物被等体积的蒸馏水代替；A1-DPPH溶液被无水乙醇代替：A-样品组吸光度。

1.2.3 抑菌试验

1.2.3.1 菌悬液的制备 先将试验所用菌株接种于平板上，在37 ℃培养基中培养24 h，然后挑选典型菌落接种于25 mL液体培养基的三角瓶内封口，35 ℃～37 ℃的摇床里震荡18～24 h，取适量菌液用无菌水稀释，使菌悬液浓度达到 108个/mL备用[10]。

1.2.3.2 测定地锦草提取物的抑菌效果，并测最低抑菌浓度(MIC)[11]菌悬液按1.2.4.1方法来准备，地锦草醇提液和水提液分别按浓度100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg/mL来准备，取上述菌悬液200 μL加入已倒好的相应培养基平板中摇均成含菌平板。将灭菌的直径为6 mm的滤纸圆片在提取物中浸泡2 h，贴于平板上，每皿4片，分别设置3个重复，每皿用灭菌的滤纸片做一份空白对照及链霉素(100 μg/mL)进行阳性对照，置37 ℃下培养24 h。记录抑菌圈大小，取平均值，测定醇、水两种提取物的抑菌活性,其中能够抑制细菌生长的最低提取物浓度，记为最低抑菌浓度(MIC)。

1.2.3.3 pH值对地锦草提取物抑菌活性的影响 地锦草提取原液的pH值分别调节为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共8个梯度，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为指示菌，用滤纸片扩散法来测定抑菌圈直径，试验重复3次。

1.2.3.4 温度对地锦草提取物抑菌活性的影响[12]用试管分装100% 提取物，分别置于80 ℃、100 ℃，120 ℃水浴处理20 min，然后降至室温。以这4种菌为指示菌采用滤纸片法测定其抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 地锦草提取物抗氧化试验

2.1.1 还原力的测定 在400～800 nm之间对提取物还原力进行测定，可见最大吸收波长为700 nm。如图1所示，地锦草醇提取物有一定的还原力，在制定的吸光度处吸光值越大还原力越大，表明还原力与提取物浓度呈现明显的量效关系。醇提物与维生素C还原力比较，当提取物含量为1.00 mL时，吸光度为0.902 A，维生素C含量为1.00 mL时吸光值为0.792 A，即提取物的还原力大于维生素C的还原力，由此可见提取物具有较强的还原力。

2.1.2 羟基自由基的清除率的测定 在410～710 nm之间进行对羟基自由基清除的测定，发现最大吸收波长为500 nm。如图2所示，地锦草提取物和维生素C对羟基自由基的清除率随着浓度的增大而增加，它们含量越大，对羟基自由基的清除率就越大。当提取物浓度大于0.6 mL时，对羟基自由基清除率大于50%，比相同质量浓度下维生素C对OH的消除率高。当质量浓度1.2 mL时两者的消除率接近，大于70%。

图1 提取物与维生素C还原力比较

图2 提取物与维生素C对羟基自由基的清除率吸收曲线

2.1.3 地锦草提取物对DPPH·自由基清除能力的测定 对DPPH·自由基清除率的最大吸收波长为520 nm。如图3所示，对DPPH·自由基也有较强的清除作用，地锦草提取物抗氧化能力随着浓度的增加而增强。当提取物浓度大于0.6 mL时，对DPPH的清除率大于50 %。维生素C对DHHP的消除活性低于提取物对DHHP的消除活性，可随着浓度的继续增加两者的消除能力逐渐接近。

图3 提取物与维生素C液对DPPH的清除能力

2.2 地锦草提取物的抑菌测定

2.2.1 抑菌效果及MIC的测定 由表1、2可见，新疆地锦草两种提取物都在一定的范围内对4种供试菌株具有抑菌活性，其中对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用，依次大肠杆菌>枯草芽孢杆菌>变形杆菌。并可以得出抑菌圈随提取物浓度的增大而扩大。其中醇，水两种提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑制浓度一致，MIC为1.56%，醇提物对对枯草芽孢杆菌和变形杆菌的最低抑制浓度为3.125%，而水提物对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为12.5%，对变形杆菌的最低抑菌浓度为25%。

表1 地锦草醇提液浓度对供试菌株抑菌效果的影响

注： 抑菌圈直径为平均值mm

表2 地锦草水提液浓度对供试菌株抑菌效果的影响

注： 抑菌圈直径为平均值mm

图4 pH值对地锦草醇提取物抑菌活性的影响

图5 pH值对地锦草水提取物抑菌活性的影响

2.2.2 pH值对地锦草提取物抑菌活性的影响 从图4和图5可以看出，两种提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用均受pH值的影响，酸性条件下的抑菌效果较好，在偏酸和碱性条件下的抑菌效果均有下降。这说明pH值的变化对地锦草提取物的抑菌活性的影响较大。

图6 温度对地锦草醇提取物抑菌活性的影响

图7 温度对地锦草水提取物抑菌活性的影响

2.2.3 温度对地锦草提取物抑菌活性的影响 由图6、7可以看出，地锦草提取物经80 ℃、100 ℃、120 ℃的加热处理20 min后，抑菌活性均有下降的趋势，但没那么明显。说明地锦草提取物具有较强的热稳定性。

3 结论

通过对地锦草化学成分和生物学活性的研究，人们发现地锦草有明显的抗菌、抗炎以及很强的抗氧化作用。地锦草是一种具有多种药理作用的药物价值很高的植物，近年来引起了国内外学者的极大重视。虽然有关地锦草提取物的体内抗氧化和抑菌作用的文献很多，但是新疆地锦草在这方面的研究报道比较少。李治建[13]，安惠霞[14]，郭鑫[15]等研究显示，新疆地锦草对红色毛癣菌的感染有治疗作用。

本试验对新疆地锦草提取物的抗氧化及抑菌活性的进行研究，结果表明，醇提取物具有一定的还原力，对羟基自由基和DPPH· 自由基均具有一定的清除作用，从各方面可以看出,提取物的抗氧化能力比维生素 C 的抗氧化能力较强。醇、水两种提取物对4种供试菌都具有明显的抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用比较明显。地锦草两种提取物均有较强的热稳定性，其在酸性条件下(pH值2～9)的抑菌效果较好，其中pH值5的条件下抑菌活性最强；在不同的温度和pH值条件下，醇提取物的抑菌能力都比水提物的抑菌能力强。

有文献报道，国内已经开始把抗氧化检测用于抗氧化，抗衰老等保健食品评价。地锦草具有很强的抗氧化能力，这对保健品的开发提供了重要的指导意义。本试验虽然明确地锦草对以上4种细菌均有抑制作用，可对抑菌活性成分及机理方面还需要进一步的研究。