上海市鸭源沙门菌的分离鉴定、血清分型及耐药性分析

瞿孝云， 许学斌， 邱荣超， 张丽娜， 符 颖， 张建民， 廖 明

(1.华南农业大学兽医学院 人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室， 农业部人畜共患病重点实验室，广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室， 广东 广州 510642 ； 2.上海疾病预防控制中心病原微生物鉴定所 上海 长宁 200336 ； 3.河南牧业经济学院动物科技学院，河南 郑州 450011)

沙门菌(Salmonella)是一种重要的人兽共患病病原菌，也是一种重要的食源性致病菌。其血清型高达2 500多种，多数对人、家畜和家禽等均有致病性，不仅给养殖业造成很大的危害，而且具有很重要的公共卫生意义。而动物源食品作为沙门菌的重要载体，是人类感染沙门菌的一个重要源头[1]。CDC数据显示,美国每年约有120万人患病，死亡数近450人[2]；中国每年大概有820万人感染，引起792人死亡[3]。国内外对禽沙门菌的研究主要集中在鸡，鸭源沙门菌研究较少，与欧洲以及美洲多数国家不同的是,我国是传统的鸭养殖与消费大国,鸭肉以及鸭蛋的产量居于世界第一位。因此,我国居民因食用受污染的鸭肉以及鸭蛋而感染沙门菌病的几率较其他国家会更高[4]。上海作为畜禽产品消费大市，畜禽产品的供应和安全性直接关系到社会稳定和人民群众健康。但目前，缺乏对上海地区鸭源沙门菌流行情况和耐药数据的监测。

因此，本研究通过对上海各大农贸市场和超市鸭源沙门菌的分离、血清学分型和药敏试验，为鸭源沙门菌的防控提供数据支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 2014年从上海市各区3家大型超市和7个零售市场随机采集不同的鸭肉制品(如鸭掌、鸭心、鸭胸肉、鸭腿、鸭翅，整鸭、鸭粪便等)样品共计186份。放入无菌采样袋内，所有样品采集后均置于低温保存箱中，于 8 h内送至实验室。

1.2 主要试剂 缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液、亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液、亚硒酸盐煌绿(SBG)增菌液、沙门菌显色培养基、无菌采样袋,均购自青岛海博生物技术有限责任公司；木糖-赖氨酸-硫酸四癸钠(XLT4)培养基、LB营养琼脂、LB肉汤、MH琼脂,购自广东环凯生物技术有限公司；API20E试条(bioM erieux, Inc.),购自北京威泰科生物技术有限公司；沙门菌属诊断血清,购自宁波天润公司；药敏纸片,购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。TaqDNA聚合酶和1 000 bp Marker,购自TaKaRa公司。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922由华南农业大学兽医学院动物传染病教研室保存。

1.3 方法

1.3.1 沙门菌分离培养 根据国家标准(GB 4 789.4-2010)规定并结合本实验室经验进行沙门菌的分离鉴定。按照每 25 g样品加 250 mL无菌BPW的原则，于 37 ℃，100 r/min的条件下进行4～6 h预增菌。移取上述1 mL增菌液分别转移于10 mL TTB增菌液和10 mL SC增菌液内，于 42 ℃±1 ℃和36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。分别用接种环取选择性增菌液三区划线接种于XLT4琼脂平板和沙门菌显色琼脂平板上，于36 ℃±1 ℃分别培养24 h～36 h，观察平板上菌落的形态。沙门菌在XLT4 琼脂平板上的典型形态为黑色、圆形、边缘透明菌落，或者无色、透明菌落；在沙门菌显色琼脂平板上显紫色。

1.3.2 沙门菌的鉴定 挑取疑似菌落，同时进行生化鉴定和 PCR 鉴定。选择沙门菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定：从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备呈浊度适当的菌悬液，取适量加入不同生化管中，至于37 ℃培养箱中过夜培养，次日观察细菌对三糖铁、吲哚、甲基红和V-P等的利用结果并记录。根据参考文献[5]，选择沙门菌属侵袭性抗原保守基因invA序列设计1对引物，P1：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′;P2：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′。由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，扩增目的片段大小为284 bp。PCR扩增条件94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。

1.3.3 沙门菌血清型鉴定 使用宁波天润公司的沙门菌属诊断血清对分离株进行血清分型，按照说明书操作，在干净载玻片上滴1滴血清，取少量被检菌苔与血清混匀，用无菌牙签轻轻混匀并于1 min 内肉眼判断结果，以生理盐水作阴性对照。出现凝集者为阳性，呈均匀浑浊者为阴性。根据测定得到的抗原式，参照White-Kauffmann-Le Minor(WKLM)抗原表，检索沙门菌的血清型[6]。

1.3.4 药敏试验 选用16种常见的抗生素药敏纸片,包括四环素(30 μg/片)、氨苄西林(10 μg/片)、奥格门汀(20 μg/片)、链霉素(10 μg/片)、庆大霉素(10 μg/片)、亚胺培南(10 μg/片)、氯霉素(30 μg/片)、头孢吡肟(30 μg/片)、头孢噻肟(30 μg/片)、头孢噻甲羧肟(30 μg/片)、磺胺异唑(300 μg/片)、复方新诺明(磺胺甲唑23.75 μg/片+甲氧苄啶1.25 μg/片)、萘啶酸(30 μg/片)、环丙沙星(5 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、甲氧苄胺嘧啶(5 μg/片)。采用WHO推荐的药敏纸片琼脂扩散法(Kirby-Baue法)测定分离菌株对抗菌药物的敏感性，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，最后测量抑菌环直径，结果参照CLSI制定的标准[7]判定敏感(S)、中介(I)和耐药(R)。

2 结果与分析

2.1 沙门菌的分离鉴定 从采集的186份鸭源样品中，分离到疑似沙门菌菌株44株。这些菌株在XLT4平板上长出黑色、圆形、半透明光滑菌落；在沙门菌显色板上呈紫色，符合沙门菌典型生长特征。将所有疑似菌株进行生化试验鉴定，都可以分解葡萄糖产酸产气，发酵麦芽糖、甘露糖，不发酵乳糖、蔗糖，不产生吲哚, H2S试验阳性、V-P试验、枸橼酸盐利用试验阴性。从电泳图谱上可以看出，扩增产物大小在284 bp左右，条带单一(见图1)。综上，本研究共分离鉴定出44株鸭源沙门菌，分离率为23.65%。

图1 沙门菌invA基因PCR检测

1～8、10～17、19～21：沙门菌分离珠； 22：阴性对照；9、18：DNA Marker DL-1 000

2.2 血清型分布 血清学分型结果(图2)显示，44株鸭源沙门菌共鉴定出13种血清型，优势血清型为鼠伤寒沙门菌19株 (43.18%)和肠炎沙门菌6株(13.64%)，其次为科瓦利斯沙门菌4株(9.09%)、德比沙门菌4株(9.09%)和阿尔巴尼沙门菌3株(6.82%)，另外还检出阿尔顿沙门菌、哈瓦那沙门菌、利物浦沙门菌、姆班达卡沙门菌、山夫登堡沙门菌、约翰内斯堡、阿贡纳沙门菌、印第安纳沙门菌各1株(2.27%)。

图2 44珠鸭源沙门菌血清型分布结果

2.3 抗生素耐药性 对44株鸭源沙门菌进行了16种常见抗生素的耐药性检测。耐药性结果(表1)显示,对萘啶酸(63.64%)、磺胺异唑(47.73%)、链霉素(47.73%)、四环素(40.91%)的耐药率最高；其次是氨苄西林(34.09%)、氯霉素(27.27%)、复方新诺明(25.00%)、甲氧苄氨嘧啶(22.73%)；对奥格门汀(4.55%)、头孢吡肟(4.55%)、头孢噻肟(4.55%)、头孢噻甲羧肟(4.55%)、环丙沙星(2.27%)、庆大霉素(2.27%)耐药率较低；但对氧氟沙星(0.00%)和亚胺培南(0.00%)两种药物敏感。

在44株鸭源沙门菌分离株中，发现5株(11.36%)不耐药，其对16种抗生素均表现敏感；20株对1～2种抗生素耐药，血清型以鼠伤寒为主；其他19株则表现出多重耐药现象(至少耐3种及3种以上抗生素)，多重耐药率为43.18%，耐药模式多样且主要的耐药表型为TET+AMP+SXT+C+W+S3(表2)。同时耐6种及6种以上抗生素的沙门菌有11株，耐11种抗生素的沙门菌有2株。

表1 44株鸭源沙门菌药敏试验结果

表2 44株鸭源沙门菌多重耐药情况

注：TET:四环素；C: 氯霉素；GEN:庆大霉素；S:链霉素；S3:磺胺异唑；W:甲氧苄氨嘧啶；SXT:复方新诺明；FEP：头孢吡肟；CTX：头孢噻肟；CAZ：头孢噻甲羧肟；IMP:亚胺培南；AMP:氨苄西林；AMC:奥格门汀；NA:萘啶酸；CIP:环丙沙星；FOX:氧氟沙星

3 讨论

沙门菌广泛存在于动物体本身、动物养殖环境和动物性食品中，是引起食物中毒最常见的病原菌之一。据相关文献报道，在我国细菌性食物中毒中，70%至80%是由沙门菌引起的[8]，而全球每年约有9 300万人感染沙门菌，死亡数高达15.5万[9]。

本研究以传统方法与PCR 鉴定相结合，最终鉴定出44株鸭源沙门菌，阳性率为23.65%，明显高于2005年李红星等[10]对河南地区鸭源沙门菌的调查(阳性率11.28%)，说明该地区沙门菌污染广泛存在于市场和超市中。提示应做好卫生监督防控，降低污染率。

本研究血清学分型结果显示，共鉴定出13种血清型。其优势血清型为鼠伤寒沙门菌(43.18%)和肠炎沙门菌(13.64%)。据报道[11]从发病鸭体内分离到肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌较多。这两种血清型感染的宿主范围广，是引起各种动物的沙门菌感染和人类食物中毒的主要血清型之一。另外还检出11种其他血清型沙门菌，如阿尔顿沙门菌、哈瓦那沙门菌、利物浦沙门菌、姆班达卡沙门菌、山夫登堡沙门菌、约翰内斯堡、阿贡纳沙门菌、印第安纳沙门菌，可以看出上海地区鸭源沙门菌血清型分布较广，因此需加强对流行菌株的监测。

本研究对44 株鸭源沙门菌进行了16 种抗生素的耐药性试验，结果显示，分离株对萘啶酸、磺胺异噁唑、链霉素、四环素的耐药性较强(耐药率超过40%)，与有关报道基本一致[12]推测这可能与生产上长期不合理使用抗生素有密切关系。头孢类药物和氟喹诺酮类药物作为临床一线用药，具有较好的抗菌疗效，可数据表明，本次分离株中已出现对此类药物的耐药菌株，对奥格门汀、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢噻甲羧肟、环丙沙星的耐药率范围在2.27%～4.55%，但分离株对氧氟沙星和亚胺培南都敏感，符合相关报道[13]。说明耐药菌株的出现与长期使用该类药物有一定的相关性。本次检测的菌株多重耐药率达43.18%，且多重耐药谱广，耐药谱型繁多。耐药最多的菌株可同时耐受11种药物，多重耐药菌株的主要耐药表型为四环素(TET)-氨苄西林(AMP)-复方新诺明(SXT)-氯霉素(C)-甲氧苄氨嘧啶(W)-磺胺异口恶唑(S3)，均为临床基础用药。同时耐6种及6种以上抗生素的沙门菌有11株。结果表明，上海地区鸭源沙门菌耐药情况比较严重，提示在养殖、临床治疗和预防过程中应该科学合理的使用抗生素。如果长期不合理的使用或滥用抗生素，将导致沙门菌耐药性的形成和耐药基因的转移，最终会对人类健康构成严重的威胁。

本研究显示，上海市各大农贸市场和超市中鸭源沙门菌污染率较高，其血清型分布广且耐药模式多样，呈现较高耐药性。提示为降低沙门菌引起的食品安全风险，有关部门应加强卫生监督以及重视对沙门菌污染和抗生素规范使用的监测。