猫杯状病毒研究进展

孟凯闻， 孟 赓， 林德贵， 张 迪， 金艺鹏

(中国农业大学动物医学院， 北京 海淀 100193)

猫杯状病毒(FelineCalicivirus，FCV)属于杯状病毒科(Calicivirudae)疱疹病毒属(Vesivirus)，为二十面体对称的球形无囊膜病毒，直径35～39 nm，病毒衣壳由排列成二聚体的180个蛋白质分子组成，形成90个壳粒，衣壳在生物组成上只含有一种蛋白(VP1)。FCV基因组为全长7 683 bp的单股正链线性RNA(ssRNA)。

FCV是一种在猫科动物中广泛传播的常见病原，病猫或健康带毒猫是本病的常见传染源，病毒随宿主分泌物和排泄物排出造成污染，易感猫通过与病猫或病猫分泌物、排泄物及被病毒污染的笼具接触而感染发病。猫可通过鼻、口或结膜途径感染FCV，感染后主要在口腔和呼吸道组织中复制，部分病毒株由于组织嗜性和致病性方面的差异也可由内脏组织、粪便和尿液中分离得到[1]。

FCV的感染通常以猫的上呼吸道和口腔病变为主，舌上频繁出现水疱和溃疡是典型的感染特征，此外还可导致四肢溃疡、跛行、流产、肺炎和猫慢性龈口炎，而高毒力FCV毒株甚至可导致死亡。

1 杯状病毒家族

FCV属于杯状病毒科疱疹病毒属。杯状病毒科分为5个属：兔病毒属(Lagovirus)、纽伯病毒属(Nebovirus)、诺如病毒属(Norovirus)、沙波病毒属(Sapovirus)和疱疹病毒属，其中仅有诺如病毒属和沙波病毒属可感染人，合称人类杯状病毒，而纽伯病毒属为新设立的病毒属[2]。杯状病毒家族的系统进化关系如图1。

图1 基于衣壳蛋白氨基酸序列以邻接法所构建的系统发育树

SSLVV：虎头海狮杯状病毒(NC_011050)；VESV：猪小疱疹病毒(NC_002551)；WCV：海象杯状病毒(NC_004541)；RVV：兔疱疹病毒(NC_008580)；FCV：猫杯状病毒(NC_001481)；CaCV：犬杯病毒(NC_004542)；SMSV：圣米格尔海狮病毒(NC_025676)；MCV：水貂杯状病毒(NC_019712)；FBCV：鼬獾疱疹病毒(NC_027122)；GoCV：鹅杯状病毒(NC_024078)；Bat_SV：蝙蝠沙波病毒(NC_017936)；PES：猪肠道沙波病毒(NC_000940)；SV-Dresden：沙波病毒德国分离株(NC_006269)；SV-Nagoya：沙波病毒日本分离株(NC_027026)；SMV10：沙波病毒泰国分离株(NC_010624)；SCV12：沙波病毒日本分离株C12(NC_006554)；EBHSV：欧洲野兔综合征病毒(NC_002615)；RaCV：兔杯状病毒(NC_011704)；BoCV：牛杯状病毒(NC_030793)；NAV1：纽伯病毒-1(NC_007916)；CITV：杯状病毒-TCG(NC_006875)；CsNV-NB：纽伯病毒-NB(NC_004064)；ASCV：大西洋鲑鱼杯状病毒(NC_024031)；SVSV：猪杯状病毒(NC_012699)；NoV_GV：诺如病毒-GV(NC_008311)；NoV_GI：诺如病毒-GI(NC_001959)；SimianNoV：灵长动物诺如病毒(NC_031324)；RHDV：兔出血症病毒(NC_001543)。系统进化树利用MEGA7绘制[3]

2 分子生物学特性

FCV基因组全长7 683 bp，为单股正链线性RNA(ssRNA)。FCV基因组3′端具polyA结构，5′端以共价键与病毒连接蛋白(VPg)相连。共包含3个开放阅读框(ORF)：ORF1(20～5 311 nt)、ORF2(5 314～7 320 nt)、ORF3(7 317～7 634 nt)，其中ORF2的终止密码子与ORF3的起始密码子具有4个重叠的核苷酸：ATGA(7 317～7 320 nt)。FCV的结构蛋白与非结构蛋白分别由不同的ORF编码(图2)。

图2 基因组阅读框及其所编码产物的对应关系

ORF1编码多聚蛋白，该蛋白经2C肽链内切酶C24(3C样半胱氨酸蛋白酶)的自催化加工作用，被切割形成非结构蛋白p5.6、p32、p39(核苷水解酶NTPase)、p30、p13(VPg)以及p76(蛋白酶聚合酶Pro-Pol)。其中经研究发现Pro-Pol的N末端具有抑制宿主基因表达的作用[4]，而其本身又可被C24切割形成用于切割衣壳蛋白前体的成熟蛋白酶和RNA复制过程中的关键蛋白RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)。编码C24的基因序列位于ORF1中编码RdRp的序列上游，与小RNA病毒中的3C样蛋白酶具有同源性，除了对自身的蛋白质进行切割外，C24亦可通过切割降解宿主细胞的细胞RNA结合蛋白抑制细胞中应激颗粒(SGs)的组装[5]。切割形成的非结构蛋白中仅VPg存在于成熟的病毒颗粒，为翻译起始所需。在成熟病毒颗粒中，VPg利用第1段α螺旋上的24位酪氨酸(Y24)与FCV基因组的5′端GDP共价连结，与起始密码子(AUG)直接相互作用，并由此处附近通过ORF1编码蛋白质[6-7]。NTPase用于切割核苷酸，此外还具有抑制细胞I型干扰素信号通路的作用[8]。ORF1合成的另外3种蛋白质：p5.6、p30、p32，此3种蛋白质具体功能仍无定论。2010年，根据Bailey等人的研究结果，表明FCV的p32、NTPase和p30蛋白与内质网(ER)的重组有关，说明它们可能在FCV的复制过程中起作用[9]。

在感染杯状病毒的细胞中有2种RNA：病毒基因组RNA(约7.6 kb)和亚基因组RNA(约2.4 kb)。后者3′端、5′端结构与病毒基因组相同，包含ORF2和ORF3阅读框，在经FCV感染的细胞内可以检测到。

ORF 2编码前体衣壳蛋白(75 kDa)，随后被ORF1编码的蛋白酶切割为成熟衣壳蛋白VP1(62 kDa)和前导衣壳蛋白LC(14 kDa)。2010年Ossiboff R J 等人利用X射线衍射法，对猫杯状病毒衣壳蛋白(PDB:3M8L)进行晶体结构分析，分辨率为3.4 A°，如中插彩版图3所示，FCV的衣壳蛋白共含有180个VP1蛋白，构成的90个拱形二聚体壳粒又组成32个中央凹陷的杯状体排列在T=3的二十面对称体上；VP1分为3个结构域，NTA、S和P，P结构域又被分成2个亚结构域P1和P2，P2结构域位于衣壳外壳和病毒颗粒的最外表面上，是大多数中和表位所在的区域[10]。

ORF3编码次要衣壳蛋白VP2(12 kDa)，每个成熟病毒颗粒中含有1或2个，VP2可影响FCV的复制、成熟、蛋白合成及病毒颗粒的形成过程，自然的病毒颗粒需VP1、VP2共同组装[11]。但人们对VP2的合成及作用机制尚不清楚。

3 致病机制

FCV的细胞受体是猫接合黏附分子-A(fJAM-A)，该分子是广泛分布于猫组织中的免疫球蛋白(Ig)超家族成员之一。2008年，Bhella等人利用冷冻电子显微镜和三维图象重建技术，分析出了FCV与其受体结合的复合物结构图，分析显示,fJAM-A 的免疫球蛋白样胞外域D1与FCV VP1的P2域外表面相结合，诱导FCV衣壳发生构象变化，据此推测FCV-fJAM-1相互作用可引发病毒的脱壳[12]。2018年，新的研究进一步调查了细胞受体与病毒间的相互作用，鉴定出了VP1蛋白上在病毒与受体结合的过程中发挥重要作用的保守残基[13]。

一般情况下，病毒侵入细胞后进行生物合成，过程中产生的双链RNA(dsRNA)经宿主细胞内线粒体上的接头蛋白传递信号，最终可活化干扰素调节转录因子3(IRF-3)，激活I型干扰素信号通路，产生抗病毒作用。但经研究发现，FCV中的非结构蛋白NTPase具有抑制IRF-3活化的作用，使得I型干扰素信号通路被阻断，宿主细胞无法产生干扰素发挥抗病毒作用[8]。

另一方面，发生病毒感染时，细胞会将mRNA存储于应激颗粒(SGs)使翻译受阻以抑制蛋白质合成，这一机制限制了能量和营养物质的利用利于细胞存活，同时可阻止病毒的增殖。SGs的组装是通过具有聚集倾向的细胞RNA结合蛋白驱动的，此类蛋白如G3BP1，与mRNA及某些细胞蛋白相互结合后形成致密的颗粒聚合体，即SGs。而FCV感染后，病毒3C样蛋白酶于E405切割位点处使G3BP1裂解，导致SGs无法装配[5]。

近年，经实验室研究还发现，FCV的致细胞病变作用(CPE)和在宿主细胞中的扩散有赖于LC蛋白与细胞膜联蛋白A2(ANXA2)的相互作用，而与CPE活性相关的关键氨基酸残基为LC序列中保守的3个半胱氨酸残基，研究中观察到LC蛋白的过度表达可导致单层猫肾细胞死亡[14]。

4 临床症状与病理变化

猫口炎是猫的常见口腔疾病，易反复发作且难以根治，诸多报道显示，猫口炎与FCV感染密切相关，但FCV在慢性口腔炎症中的具体作用尚未经实验室研究阐明。经研究表明，FCV不是慢性口炎的唯一致病作用，并推测该病可能并非由FCV单独直接致病，而与宿主的免疫应答具有更高的相关性[15]。

主要表现为口腔黏膜红肿、增生，严重时出现溃烂，患猫常有流涎、口臭症状，且伴有采食困难、咀嚼障碍。病理检查显示，轻度炎症(1级)时感染区域内上皮细胞轻度增生、角化不全，固有层和黏膜下层炎性细胞增多；中度炎症(2级)时上皮细胞在变性/溃疡区域内不同程度变性，固有层和黏膜下层炎性细胞继续增多且聚集在一起形成带状；严重感染(3级)时，感染区域内上皮细胞变性、水肿，形成溃疡，渗出物内含有多量巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞，固有层和黏膜下层中大量炎性细胞浸润、出血[16]。

5 诊断、治疗与预防

FCV的诊断方法包括：通过临床症状判断、病毒的分离培养、RT-PCR和血清学测定。其中临床常用的检测方法为RT-PCR，咽拭子是首选采样方法。近期，又有学者提出结合应用新一代测序技术(NGT)与目标基因捕获技术(TGC)，有可能解决在多病原复杂样品中检测低拷贝数目标病原体的问题[17]。而目前市场上可应用于临床的商业化FCV快速检测卡仍是空白。

猫口炎的治疗包括手术治疗和非手术治疗，对于红肿发炎病例和溃疡较轻的病例采用非手术治疗的方法较好，而对于溃疡严重和流涎不能进食病例采用手术治疗方法较好[18]。手术治疗以全口拔牙和切除增生组织为主；非手术治疗则包括给予抗生素、皮质类固醇、非甾体抗炎药(NSAIDs)，由于NSAIDs的疗效不佳，长效皮质醇常作为药物首选。但长期使用长效皮质类固醇，具有诱发猫的II型糖尿病(DM)的风险，因此长期使用皮质类固醇药物在治疗慢性猫口炎中仍存在争议的[19]。

最近提出的针对FCV及其所引起的临床症状的药物有如下几种：泛昔洛韦，作为核苷酸类似物，可在细胞或病毒聚合酶参与的DNA或RNA链起始和延伸阶段与生理核苷酸竞争，临床有治愈全身性FCV感染的案例[20]；2015年，Kim Y等人新合成了靶向作用于FCV复制所必需的3C样蛋白的肽基化合物，这些成分在染病的小鼠模型和细胞培养中表现出了广泛的抗病毒活性和安全性[21]；此外，还有免疫调节化合物重组猫干扰素-ω(rFeIFN-ω)，临床有两例携带FCV的慢性龈口炎综合征患病猫在口服干扰素60 d后痊愈[19]。

目前，猫口炎尚无特效疗法，应以预防为主，注意饲养管理和口腔卫生。FCV的预防主要通过接种疫苗，FCV疫苗以减毒活疫苗和灭活疫苗为主。近期有研究表明，鼻内接种实验室灭活的无佐剂FCV全病毒颗粒可对同源病毒产生免疫，同时抑制异源病毒增殖[22]；另有研究指出，初次皮下接种疫苗21 d后，进行1次经口服(舌下)的加强免疫，可增强FCV疫苗的疗效[23]，但该方法不易于制成目前市场更流行的联苗。传统疫苗在病毒防制过程中起到重要作用，但只能减少临床发病率和病毒的排出，无法防止感染，随着分子生物学、基因工程技术的发展，也不断有学者尝试新型疫苗的研究。

6 展望

猫口炎作为猫的常见病，严重影响猫科动物生活质量，甚至有致死风险，然而尚无特效疗法，目前以预防为主。针对这一问题，应从FCV与猫口炎的高度关联性入手，通过对FCV结构特性及感染机制的研究，改进其现有的检测方法，制作快速、灵敏的临床检测试剂盒；以病毒衣壳的组装机制和与受体分子的相互作用为研究切入点，研发更有针对性的抗病毒药物；同时研制新型疫苗，解决免疫失败问题，更好的防控FCV相关疾病。