miR--200a与金雀异黄酮对胃癌细胞生长及侵袭能力的影响

孙庆敏,王 进

南京中医药大学附属医院药学部 南京 210029

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在发展中国家尤为高发；中国胃癌患病人数占全世界的42%[1]。目前手术切除仍是原发性胃癌最主要的治疗手段，但实际上手术时有可能就已经发生了肿瘤细胞的转移扩散。因此如何减少胃癌术后复发转移已成为提高胃癌疗效的关键[2]。近年来，随着分子生物学的发展和对癌症发病机制的深入研究，肿瘤的治疗也正在发生变革，特别是精准化治疗概念提出之后，针对胃癌的治疗更需结合病理、基因及蛋白组学等资料。诸多研究已经证实miRNAs参与了肿瘤的发生、发展及预后。我们之前的研究[3]证实miR--200a可抑制卵巢癌的侵袭，并与卵巢癌的临床病理分期及转移密切相关。诸多研究[4--5]已发现金雀异黄酮通过影响一系列的细胞进程如细胞周期、凋亡、血管新生等发挥抗癌作用。我们之前的研究[6--7]也发现金雀异黄酮可抑制胃癌7901细胞、葡萄膜黑色素瘤细胞增殖。因此，我们观察了金雀异黄酮与miR--200a单用及联用对胃癌细胞生长、侵袭的影响，并探讨可能的相关分子机制。

1 材料与方法

1.1材料人胃癌细胞株MGC803、BGC823、MKN45由江苏省中医院中心实验室提供。RPMI 1640 培养基及胎牛血清(Hyclone公司)，miR--200a mimic、NC mimic(上海吉玛基因公司)，金雀异黄酮(Sigma公司)，MTT检测试剂盒(碧云天公司)，8 μm Transwell 小室(BD公司)，双荧光素酶报告基因检测系统(Promega公司)，Sybr green(Toyobo公司)，兔抗人EphA2 抗体、兔抗人GAPDH抗体(Santa Cruz公司)，Lipo--2000(Life Technologies公司)，逆转录试剂盒(TaKaRa公司)，TaqMan®MicroRNA 逆转录试剂盒(ABI公司)，Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(millipore，WBKLS0100)。德国Hettich MikrO 200R冷冻离心机，酶标仪、细胞培养箱(Thermo fisher公司)，倒置显微镜(Olympus公司)，ABI Prism 7300 PCR系统(ABI公司)，GloMax 96 微孔板发光检测仪(Promega公司)。

1.2细胞培养与分组取MGC803、BGC823、MKN45细胞，在含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于体积分数5%CO2、37 ℃条件下培养。

分别取MGC803、BGC823、MKN45细胞，接种于96孔板，每种细胞分别接种12孔，每孔约5 000个细胞，培养24 h后分为4组(每组3孔)：阴性对照组(转染NC mimic)、金雀异黄酮组(加入50 μmol/L金雀异黄酮)、miR--200a组、联合组(miR--200a mimic转染联合50 μmol/L的金雀异黄酮处理)，6 h后，换成完全培养基。

1.3各组细胞生长情况3种细胞分别按照1.2分组处理后培养24 h，每孔加入50 μL MTT，继续培养4 h，然后每孔加入500 μL Formazan溶解液，直至在光学显微镜下观察Formazan全部溶解，酶标仪上于570 nm处测定吸光度(A)。细胞存活率=(实验组A值-调零孔A值)/(对照组A值-调零孔A值)，其中对照组为不加任何处理的细胞。

1.4各组细胞侵袭能力的变化3种细胞分别按照1.2分组处理后，将1×104个细胞接种到Transwell的顶部室中，将含有体积分数10%胎牛血清的培养基填充在底部室中。 24 h后，从膜的顶部除去非侵入性细胞。然后用甲醇固定细胞，结晶紫溶液染色，100倍倒置显微镜下计数5个视野的细胞数，取平均数。

1.5各组细胞EphA2mRNA表达的检测3种细胞分别按照1.2分组处理后，提取RNA。采用荧光定量RT--PCR评估EphA2 mRNA的表达水平。EphA2正、反向引物(5'～3')：GGGACCTGATGCAG AACATC和AGTTGGTGCGGAGCCAGT;GAPDH：TGTTCGACAGTCAGCCGC和GGTGTCTGAGCGAT GTGGC。使用2-ΔΔCT方法计算EphA2 mRNA的表达水平。

1.6各组细胞EphA2蛋白表达的检测取BGC823和MKN45细胞，按照1.2分组处理48 h后在RIPA裂解缓冲液中裂解，蛋白通过100 g/L SDS--PAGE分离并转移到PVDF膜。将膜与兔抗人EphA2抗体(按1 ∶200稀释)或兔抗人GAPDH抗体一起孵育，加入二抗，ECL显色，并用Quantity One软件定量。以目的蛋白与GAPDH条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达水平。

1.7统计学处理采用SPSS 15.0处理数据，采用2×2析因设计的方差分析探讨miR--200a和金雀异黄酮单用或联用对胃癌细胞生长、侵袭能力及EphA2 mRNA和蛋白表达的影响。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1miR--200a和(或)金雀异黄酮对胃癌细胞生长的影响MTT结果显示，金雀异黄酮可抑制MGC803细胞生长，而miR--200a可抑制MKN45细胞生长，二者对这两株细胞生长的影响均无交互作用。金雀异黄酮和miR--200a单用均可抑制BGC823细胞生长，且二者联用有协同作用，见表1。

表1 miR--200a和(或)金雀异黄酮对胃癌细胞存活率的影响

2.2miR--200a和(或)金雀异黄酮对胃癌细胞侵袭能力的影响金雀异黄酮可抑制MGC803和MKN45细胞侵袭能力，而miR--200a可抑制MGC803和BGC823细胞侵袭能力，二者联用对这3种细胞侵袭能力的影响均无交互作用。见表2。

表2 miR--200a和(或)金雀异黄酮对胃癌细胞侵袭能力的影响

2.3miR--200a和(或)金雀异黄酮对胃癌细胞EphA2mRNA相对表达量的影响在MGC803细胞中未观察到miR--200a或金雀异黄酮对EphA2 mRNA表达的影响；但在MKN45细胞中miR--200a可抑制EphA2 mRNA表达；在BGC823中金雀异黄酮可一定程度抑制EphA2 mRNA表达(P=0.054)。见表3。

表3 miR--200a和(或)金雀异黄酮对胃癌细胞EphA2 mRNA相对表达量的影响

2.4miR--200a和(或)金雀异黄酮对胃癌细胞EphA2蛋白表达的影响miR--200a及金雀异黄酮均可抑制BGC823细胞EphA2蛋白的表达，且二者联用有协同作用；MKN45细胞中，金雀异黄酮单用及与miR--200a联用均可抑制EphA2蛋白表达。在MGC803细胞中，EphA2蛋白表达量极低，故未做给药或转染实验。见图1、表4。

1～4:分别为阴性对照组、miR--200a组、金雀异黄酮组及联合组

图1miR--200a和(或)金雀异黄酮对胃癌细胞EphA2蛋白表达的影响

表4 miR--200a和(或)金雀异黄酮对胃癌细胞EphA2 蛋白表达的影响

3 讨论

诸多研究[4--5]已经发现金雀异黄酮通过影响一系列的细胞过程如细胞周期、凋亡、血管新生等发挥抗癌作用。我们之前的研究[6]也发现金雀异黄酮可抑制胃癌7901细胞增殖。因此本研究我们扩大在另外3株胃癌细胞中观察金雀异黄酮对胃癌细胞生长及侵袭的作用。结果显示，金雀异黄酮单用可抑制MGC803、BGC823细胞生长及MGC803、MKN45细胞侵袭。

miR--200家族被发现与胃癌生成、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及分级密切相关[8]，且诸多基于我国范围内的胃癌人群研究[9--11]已显示miR--200a在胃癌中低表达，提示miR--200a在胃癌中可能发挥抑癌基因的作用。鉴于此，本研究观察了给予外源性miR--200a mimic是否可以抑制胃癌细胞生长，结果发现miR--200a可抑制胃癌细胞MKN45、BGC823生长，而且其与金雀异黄酮可协同抑制BGC823细胞生长。3种胃癌细胞株遗传背景信息的差异可能是导致其协同效应不一致的原因。此外，Transwell实验也证实miR--200a可抑制胃癌细胞MGC803和BGC823侵袭，这一发现为之后开发抗癌药物提供了新途径。

miRNAs通过与靶基因转录的mRNA的3’非编码区结合，从而调节靶基因的表达，在肿瘤发生发展过程中发挥癌基因或抑癌基因作用。我们之前的研究通过生物信息学及荧光素酶报告系统在卵巢癌中证实了EphA2为miR--200a的直接功能靶基因之一。因此，本研究在预实验中观察同时转染miR--200a及EphA2 3’UTR荧光质粒的胃癌细胞，结果发现miR--200a可抑制其荧光活性，可见在胃癌中EphA2也为其靶基因之一，但是否为功能靶基因尚需进一步验证。EphA2作为蛋白酪氨酸激酶跨膜受体成员之一，与肿瘤的血管生成、上皮间质转化密切相关。前期研究[12]已发现EphA2阳性表达与胃癌的发生、发展及转移密切相关。本研究结果显示miR--200a可抑制BGC823胃癌细胞中EphA2蛋白表达，且联合金雀异黄酮可进一步加强该作用。

综上所述，miR--200a与金雀异黄酮可能通过调控EphA2抑制胃癌细胞生长及侵袭，且二者存在部分协同作用。上述实验研究为后期针对miR--200a或EphA2开发药物提供了理论基础，亦为miRNAs药物联合传统药物治疗胃癌提供了研究基础。