狨猴人工辅助生殖技术及基因修饰模型研究进展

滕永康，刘云波

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，北京 100021)

普通绵耳狨猴(Callithrixjacchus，common marmoset)，属于类人猿亚目，狨猴科。它们是一种体型较小的非人灵长类动物，来源于巴西东北部，近大西洋的热带雨林中[1]。它们因头顶耳后各有一簇白色绒毛而得名。目前，狨猴在生物医学领域[2]研究较为广泛，尤其是在生殖生物学、神经科学、药物动力学及药物的毒性筛查[3]、干细胞研究[4-5]、自身免疫性疾病、再生医学、感染性疾病动物模型，如登革热[6]方面都具有较大的潜能。

成年狨猴体长20 ～ 30 cm，体重一般为350 ～ 450 g；人工繁育群体中的狨猴寿命，一般为(148.5±6.1)个月[7]。狨猴喜群居，一般每个群体的成员数量在10只左右；彼此可通过复杂的发音，进行个体和群体间交流[8]。每个家族中只有一只雌性狨猴有交配权利，多数狨猴是一雌一雄制。雌性狨猴妊娠期为140 ～ 150 d，分娩多在夜晚，一胎可分娩2 ～ 4只，3只居多，或异卵双生[9]，但每胎成活一般不超两个[10]。泌乳不抑制发情，即分娩后可立刻进入下一个卵泡发育期，准备受孕，因而一年可生两胎。幼猴生长14 ～ 15月可达性成熟。但在野外，在一个家族群体内，不是族长的雄性没有交配权。狨猴的发情周期为(28.63±1.1) d，其中卵泡期为(8.25±0.3) d，黄体期为(19.22±0.63) d[11]。Cui等[12]首次对雌性狨猴进行生殖系统解剖探究，发现狨猴阴道总长3.4 mm；子宫平均大小为8.4 mm × 10.0 mm × 6.4 mm；卵巢为5.3 mm × 4.3 mm × 3.8 mm；输卵管平均长度为10.5 mm，宽度为1.5 mm。

1 狨猴辅助生殖技术

1.1 狨猴精液采集

精子采集是辅助生殖的重要环节，采集的精子数量和质量直接关系到整个实验的成败。目前精子采集主要有：附睾采集法，人工按摩刺激法，直肠或阴茎电刺激法，阴道冲洗法，阴茎震荡刺激法，假阴道法等等。狨猴雄性外生殖器较小，因此，针对狨猴精液采精主要为直肠电刺激方法，阴道冲洗法和阴茎震动刺激法。1991年，Cui等研究者[13]尝试使用直肠电刺激方法成功采集到精液。Morrell等[14]对比阴道冲洗法和直肠电刺激法后发现，阴道冲洗法在成功率、重复性上优于直肠电刺激，但操作较繁琐，易掺杂阴道分泌物造成细胞污染。Morrell等[15]从附睾采集精子悬浮液，浓度为每毫升1.5 × 107～ 5.2 × 107个，存活率73% ～ 91%，活力70% ～ 90%。Kuederling等[16]尝试使用阴茎震动刺激方法进行采精，结果发现：阴茎震动刺激采精是更优化的采精方法，总量和精子浓度均是直肠电刺激方法采精的3 ～ 4倍。后来，Schneiders等[17]对采精震动器进行改进，采精效率大幅提高(由52.3%提到至89.4%)。同时，无需麻醉，大部分研究者仍在沿用此方法。

1.2 超数排卵和卵母细胞采集

可超数排卵前利用同期发情来获得更多的供体，同期发情分为延长黄体期和缩短黄体期两种，狨猴多采用后者，Summers等[18]研究发现，前列腺烯醇(PGF2α)可以作为前列腺素的相似物来加速黄体消融，同时还发现在卵泡期的第8 ～ 17天即黄体期的中后期PGF2α作用效果更显著。Gilchrist等[19]发现，窦状卵泡的总数与卵巢的质量和体积成正比，与动物年龄成反比，而且，通过每天测定卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、孕酮发现，动物在卵泡期的第9.4天处于排卵期，为狨猴繁殖生产提供了基础数据。针对狨猴的超数排卵，科学家们做了很多优化，Marshall等[20]使用重组人卵泡刺激素(rhFSH)进行超数排卵刺激，每天剂量分别有0、10、25和50 IU，每天刺激50 IU的实验组动物平均产生应答的卵泡数明显高于其他三个组分，卵泡数平均为(14.1±1.6)个，在产生的380个卵泡中有267个未排卵的卵泡，采集回收率为51%，第一极体率为85.2%，受精率为57%，桑椹胚率为58%，囊胚率为47%，透明带破处率为34%。

卵母细胞的采集方法上，在2003年，Marshall等[20]借助腹腔镜，利用自制装置穿刺采卵，回收率为51%。

1.3 卵母细胞体外成熟

狨猴卵母细胞的培养基的研究最早可以追溯到1993年，Wilton等[21]使用α-MEM培养基培养卵母细胞时发现胚胎发育状况与卵母细胞成熟状况关系不大，与卵母细胞预孵育的时间有关，孵育9 ～ 11 h胚胎发育较好。随后Gilchrist等[22]明确提出在Waymouth’s培养基中体外培养的狨猴卵泡可以促进优势胚胎移植前的发育。Tkachenko等[23]发现表皮生长因子(EGF)对卵母细胞的作用效果显著，即低浓度抑制、高浓度促进。Tkachenko等[24]还发现，雌二醇在狨猴卵母细胞体外成熟以及胚胎发育过程中发挥着重要作用，但前提是需要维持在某个合适的浓度范围内。

1.4 胚胎获取

胚胎获取方法分为自然交配后胚胎冲洗回收和体外受精培养，体外受精又分为精卵共培养(invitrofertilization，IVF)和单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)方法。1994年，Thomson等[25]介绍了一种冲洗子宫获得着床前胚胎的方法，平均每次冲洗一个胚胎，效率较低。Ishibashi等[26]创造性地使用超声波介导实现无创伤胚胎回收，可以回收90%的排卵物，很大地提高了胚胎回收效率。2009年，Sasaki等[27]发现，自然交配后获得的胚胎比通过IVF获得的胚胎拥有更好的生殖潜力。研究者对于IVF方法中受精液以及胚胎培养液进行了较多的探索研究，尝试使用的受精液包括G1.2[20](57%)、G2-HSA[28](88.5%)、TYH[29](60% ～ 78.6%)。2014年，Takahashi等[30]首次利用ICSI方法生产出狨猴子代，并比较了不同注射时间囊胚率和受孕率，发现在相对于第一极体出现3 ～ 10 h，在1 ～ 2 h组的囊胚率最低。同时，研究者还对比了ICSI和IVF的效率，发现在卵裂率和囊胚率数据上，二者没有明显差异。在提高受精率上，Morrell等[31]利用阴道冲洗法，获得精子后分别使用鲜精和冻精进行受精情况比较，详见表1。

表1 阴道冲洗法获得精子后，鲜精和冻精的受精情况比较Table 1 Comparison of fertilization between fresh and cryopreserved sperm by washing the vagina

研究者Valle等[32]利用计算机精液分析系统通过分析精子头部尺寸和形态来进行精子亚群分布，进而挑选较好的精子进行受精，提高生殖成功率。同期，江勤芳等[33]针对非人灵长类动物体外受精及胚胎移植的手术室建设及使用进行了探讨，为相关科研人员提供参考。

1.5 胚胎移植

狨猴的胚胎移植主要有四部分内容：胚胎的选择、受体动物的选择、移植方法和早期妊娠检查，按照供受体动物生理状态可分为同步处理和异步处理两种，同步处理是供受体同时在排卵期后5 ～ 8 d进行胚胎移植，异步处理则是供体比受体进入排卵期早至少2 d，即受体排卵后2 ～ 4 d而供体是6 ～ 8 d，结果显示异步移植明显优于同步移植[34](着床率前者44%，后者9%；妊娠率前者33%，后者0%)。Hanazawa等[35]发明了一种微创经腹部收集胚胎的方法，经验证，在早期胚胎(受精卵/桑椹胚)回收效率上比传统的解剖收集胚胎更高效(前者76.1%，后者52.6%)，创伤小，术后恢复快，为狨猴胚胎收集开辟新方向。Takahashi等[30]成功使用腹腔镜辅助的阴道套管的方法进行胚胎移植，37个囊胚期胚胎移植入20个受孕母体中，4只受孕，成功率10.8%。Ishibashi等[36]尝试借助超声影像使用更少的移植量(小于1 μL)完成冷冻和晚期胚胎操作并取得成功，研究者使用更细的注射器，避免了回声沿套管流动对视觉造成干扰，结果受孕率和出生率均高于之前2 ～ 3 μL注射量的结果。

2 狨猴基因修饰

转基因技术原理主要有原核注射法，精子载体法，病毒感染法，转基因体细胞核移植法，诱导性多能干细胞法等，目前转基因技术在啮齿类动物上发展已经比较成熟，然而人类和啮齿类之间在解剖学和组织学、生理学存在较大差异，使得部分人类疾病不能用啮齿动物建模，因而生命科学领域需要开发建立非人灵长类动物转基因技术方法[37]。与此同时，人们在关于狨猴作为非人灵长类动物进行转基因技术研究是否合适的话题上开始形成分歧。Olsson等[38]以综述的形式总结分析了各方的观点，指出，以狨猴作为动物模型进行研究不会引起更多的伦理争议。而后经过探索，转基因灵长类动物制备方法主要以病毒感染法为主，2009年，Sasaki等人[27]通过向胚胎中注射在蔗糖溶液中自失活的，含EGFP基因的慢病毒载体生产出首批转基因狨猴。同时，还实现了转基因的种系传递。F2代狨猴同样携带相应基因型和表型，表明，一种新型的与人基因型更相近的人类疾病动物模型建立了。之后，狨猴因操作方便，繁育高效，不含致命的人畜共患病如疱疹B病毒[37]等优势在近几年受到越来越多的重视，研究者Matsuzaki等[39]尝试使用含有GFP的腺相关病毒9型(rAAV-9)载体进行狨猴枕大池和小脑皮质注射，两种给药途径均实现在运动神经元中的高效转导。Borel等[40]对9只狨猴腰椎穿刺在蛛网膜下腔注射分别含有miR-SOD1的rAAV rh10病毒载体，并以GFP作为对照组，给药23 d后发现，在整个脊髓处实现SOD1基因沉默。2016年，Park等研究者[41]成功制作出8只能够表达基因编码钙离子指示剂(GECIs)的转基因狨猴，在不同的组织中鉴定到钙离子指示剂稳定存在并发挥作用，本次实验依然采用向受精卵中注射携带GFP和GECI家族的慢病毒载体的方式获得转基因受精卵，并通过检测转基因狨猴的卵泡中GECI的表达确定该方法实现种系传递，同时实现活体动物的神经活动功能性光学成像。该研究者还指出，狨猴腺相关病毒或慢病毒介导的转基因方法不仅受限于病毒的接种时间，而且还需考虑病毒的嗜亲性、滴度、注射剂量以及启动子的构建和神经元的基因表达。而在此期间，研究者在其他非人灵长类动物基因修饰方面也取得可喜成果，2014年，Liu等[42]通过TALEN介导使一个X染色体连锁的MECP2基因发生突变，生成出生即患有雷特综合征的转基因恒河猴和食蟹猴，同时未检测到脱靶突变，证明TALEN介导的靶突变能够成为制作携带人类疾病的非人灵长类动物模型的有力工具。同年，牛昱宇[43]成功利用CRISPR/Cas9方法获得基因定向敲除食蟹猴，研究者选择了分别与性别决定、代谢系统和免疫系统疾病密切相关的Nr0b1、PPAR-γ和Rag1基因，注射成功率为44.6%，对两只幼猴进行鉴定发现均为阳性。初步证实了利用TALEN和CRISPR/Cas9系统进行非人灵长类动物进行基因修饰的可行性。

3 展望

目前基因修饰水平的趋于成熟为非人灵长类转基因动物制作创造了很多机遇，转基因狨猴因生物学特性、饲养成本、繁殖效率等方面的特定优势为干预和治疗人类疾病的发展奠定了良好的基础。当然，也存在着不足之处。第一，狨猴辅助生殖技术的很多细节仍不成熟，如卵母细胞及胚胎的冻存复苏，胚胎的体外培养和移植效率等，使得研究者在获得转基因狨猴前需要很多的供体和受体猴，无形中加大了实验成本，增加了基因修饰狨猴研究开展和普及的难度，限制了基因修饰狨猴的研究发展。第二，目前狨猴转基因技术主要存在日本、美国等国家，国内对狨猴尤其是转基因狨猴的研究仍处在初步阶段，很多研究技术和方法仍需进一步验证和摸索，研究工作任重而道远。第三，由于具有生殖能力的胚胎干细胞和体细胞核移植尚未广泛应用在非人灵长类动物上，狨猴的转基因技术仍局限在慢病毒介导的方法上，外源基因的随机插入不能从根本上达到精确基因修饰效果，需要进一步研究和完善基因修饰方法。第四，据以往的报告，狨猴的胚胎成功移植率并不高[30, 34, 36]，因此整个狨猴的ART各个环节，均有待进一步研究和提高。尽管目前转基因狨猴技术还存在种种不足，相信随着狨猴人工辅助生殖技术体系的不断完善，一方面狨猴资源数量会得到更快的提升，另一方面，技术细节的不断优化，也能相对降低狨猴的实验使用数量，同时，相信随着越来越多聚焦狨猴的科研力量的加入，更多的转基因技术方法将被应用在狨猴上，即产生更多宝贵的非人灵长类动物人类重大疾病模型，无疑对生命科学乃至整个生物医学的基础应用研究意义重大。