慢性束缚应激联合特殊饮食制备腹泻性肠易激综合征(IBS-D)大鼠模型的研究

马晓玲，夏提古丽·阿不利孜，石磊岭，陈 刚，刘雪松，张大鹏，魏鸿雁*

(1.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，乌鲁木齐 830002； 2.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830002)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种以慢性或者反复发作的腹痛伴排便习惯改变为特征的功能性肠病，并缺乏形态学和生化标志的异常。IBS是一种全球性疾病，人群患病率较高，其症状可反复发作，严重影响患者的生活质量，并占用了大量的医疗资源[1]。根据患者排便情况可分为便秘型肠易激综合征(constipation-predominant of irritable bowel syndrome，IBS-C)、腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant of irritable bowel syndrome，IBS-D)和腹泻便秘交替型肠易激综合征(alternating-predominant of irritable bowel syndrome，IBS-A)，临床上以IBS-D最为多见。IBS-D一直是中药方剂治疗消化系统疾病的研究热点，然而对该病的实验研究难点之一是迄今未有理想的动物模型[2]。IBS-D作为IBS的一个亚型，除了腹痛和腹部不适之外，腹泻是其主要症状，内脏高敏感性是其主要特征，基于内脏高敏感模型，叠加致泻是目前复制IBS-D的一个思路。

在现有造模方法中，两种方法联合建模所占比例占一半以上，Barone等[3]建立了冷环境+束缚应激法的IBS-D大鼠模型，袁秀荣等[4]以束缚应激+番泻叶灌胃法建立了肝郁脾虚型IBS模型，赵文娟等[5]以夹尾刺激+醋酸灌肠法建立了内脏高敏感性IBS模型，诸如此类两种方法建模的文献报道很多，这其中高乳糖饲料喂养结合束缚应激刺激法操作简单易行且对动物损伤小。然而由于药物制备方法及束缚造模工具等差异，很难量化不同造高乳模方法的应激强度，难以把握模型的具体程度和分期。因此本研究基于主流的造模方法[6-8]，进一步观察不同乳糖比例、束缚时间及造模持续时间对模型造成的影响，以期量化其中的量效与时效关系，弥补现有造模方式的不足，为中药方剂治疗等研究提供可靠的动物模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠40只，体质量140 ～ 160 g，6周龄，雌雄各半，由新疆实验动物中心提供[SCXK (新) 2016-0001]。饲养条件：SPF级实验室，相对湿度：30% ～ 40%，温度：20℃ ～ 30℃[SYXK (新) 2016-0007]；SPF级饲料由新疆实验动物中心提供，高乳糖饲料按相应配比自制。保持各组实验动物饲养条件一致。实验期间，遵循3R原则给予实验动物人道主义关怀。动物实验的开展取得了新疆维吾尔自治区中药民族药研究所实验动物伦理委员会批准(编号：IACUC2015-03-002)。

1.2 主要试剂与仪器

乳糖(上海昌为医药辅料技术有限公司，批号：81112812)；生理盐水(国药集团新疆制药有限公司，批号：1503015)。MD3000型多道生理仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)；LG103型饲料颗粒机(曲阜市林工机械有限公司)；尼康正置显微镜(日本Nikon公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组和模型制备

大鼠适应性饲养1周，按体质量水平随机分为5组：正常对照组、模型A组(30%乳糖+束缚1 h)、模型B组(30%乳糖+束缚1.5 h)、模型C组(45%乳糖+束缚0.5 h)、模型D组(45%乳糖+束缚1 h)，每组8只，雌雄各半。除正常组外，其余各组饲喂相应比例乳糖饲料，并每日上午进行束缚应激：用医用橡皮膏束缚大鼠双后肢，并悬挂于1 h，使之无法行动，烦躁不安，造成一定的应激刺激，正常组不做干预。

1.3.2 日常观察

每日观察动物状态：进食进水、激惹行为、好斗倾向、排便次数、粪便形态、毛色和精神状况。

1.3.3 粪便形态及其含水量[9]

分别于造模前1 d和造模第7、10、14天将大鼠单独置于代谢笼中饲养12 h后收集粪便，采用Bristol分型积分[10]评价动物的粪便形态，积分方法见表1，并采用《中国药典》2015版附录水分测定方法测定粪便含水量。

1.3.4 容量阈值[11]

分别于造模后第7、10、14天测定各组大鼠腹部回缩反射的容量阈值。测定前禁食禁水12 h，各组大鼠分别于清醒状态下放入自制的固定器，将6 F导尿管经肛门缓慢插入，气囊末端距肛门约2 cm并固定。30 min后经外口气囊内先后注入37℃生理盐水(0.8，0.9，1，1.1，1.2 mL)扩张，以腹部回缩反射作为标准，记录容量阈值。为得到准确的评估结果，对每一阈值都重复进行3次扩张，数据取均值。

1.3.5 在体平滑肌运动[12]

分别于造模第7、10、14天测定各组中随机抽取的3只大鼠。各组大鼠禁食12 h，灌胃新鲜牛乳(20 mL/kg)1 h后，麻醉、固定后于剑突下2 cm处做正中切口，剪开后分离出回肠，将针式电极正、负极按要求连接，多道生理信号采集处理系统记录餐后1 h空肠平滑肌运动波，分析计算运动波振幅和频率。

1.3.6 结肠组织病理检查

大鼠解剖后对肠组织进行肉眼观察，截取结肠中段进行病理观察。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各种造模方式的日常观察和体质量变化

造模前，各组动物毛色和精神正常，粪便呈香肠状，表明光滑柔软。造模后第4天起模型A、B、D组动物均出现易激惹、少动、皮毛凌乱无光泽、肛门有不成形粪便附着，造模第7天起模型C组也出现上述症状。与正常对照组比较，各组大鼠的体质量水平在第7、10、14天也出现不同程度的降低，体质量变化趋势见表2。

2.2 各种造模方式对粪便形态和含水量的影响

粪便形态以Bristol分型积分法描述并计算平均值，结果见表3，同时收集每只动物24 h内排便，称量粪便干、湿重，计算粪便含水率，分别与正常对照组进行组间对照，至第7天起，各模型组粪便Bristol积分值发生显著改变，各模型组大鼠粪便含水量也较正常对照组发生显著变化，如表4所示，各模型组大鼠的粪便含水量均显著升高。表明四种造模方式均在7 ～ 14 d内发生腹泻。

表1 Bristol分型积分标准Table 1 Bristol classification integration standards

表2 各组动物体质量变化Table 2 Changes in body mass of the rats in each group

注：与正常对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表3 各组大鼠粪便Bristol分型积分值Table 3 Bristol classification integral values of rat feces in each group

注：与正常对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表4 各组大鼠粪便含水量Table 4 Fecal water content of the rats in each group

注：与正常对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.3 各种造模方式对腹部回缩反射的容量阈值的影响

分别于造模后的第7、10、14天以CRD球囊法测定动物的腹部回缩反射的容量阈值，以此考察其胃肠道敏感程度及其时间变化。如表5所示，在造模后第7、10、14天，与正常对照组比较，四个模型组的容量阈值均发生明显降低，其中模型D组尤为明显(P< 0.01)，且模型C、D两组较模型A、B两组的腹部回缩反射的容量阈值更低，而随时间延长，各组内容量阈值差异无显著性(P> 0.05)，表明乳糖饲料比例的改变对动物胃肠道敏感程度的影响更大，且模型在造模7 ～ 14 d内保持稳定。

表5 各组大鼠腹部回缩反射容量阈值变化Table 5 Changes in capacity threshold of abdominal retraction reflex of the rats in each group

注：与正常对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.4 各种造模方式对在体平滑肌运动的影响

经多道生理信号采集处理系统记录餐后1 h空肠平滑肌运动，与正常对照组比较，各模型组大鼠空肠平滑肌运动波振幅均显著升高，以模型D组尤为明显(P< 0.01)。在平滑肌运动波频率的改变上，除模型C组外，各模型组大鼠空肠平滑肌运动波频率均显著降低，其中模型B、D两组的平滑肌运动频率更低，而随时间延长，各组内平滑肌运动波振幅和频率均未发生明显改变(P> 0.05)，表明束缚0.5 h并不能改变动物胃肠应激节律，结果见表6所示。

表6 各组大鼠餐后1 h空肠平滑肌运动波振幅和频率Table 6 The wave of jejunum smooth muscle movement in rats at 1 hour after feeding

注：与正常对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.5 结肠组织病理改变

模型C组和模型D组结肠缩短，可见淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润，模型B组可见淋巴细胞浸润，其余各组未见异常(见图1)。

3 讨论

IBS-D按其症状归属中医“泄泻”、“腹痛”等病症范畴，与“大肠泻”、“痛泻”等关系密切，病位在肠腑，与肝、脾、肾等脏腑功能失调相关，中医对其认识有着悠久的历史，在多部古籍文献资料中均有记载。近代中医认为肝郁脾虚、肝脾失和是其基本病机，历代医家对其认识不断深化，提出了一系列治疗方剂，如痛泻药方、芍药甘草汤、柴胡疏肝散、逍遥散、胃肠安丸、易激胶囊等在临床上多有应用[13]。

目前尚无公认统一的IBS-D实验动物模型，IBS发病原因复杂，可能涉及胃肠道动力障碍、内脏感觉过敏、脑肠轴紊乱、肠道菌群失调、肠道炎症和免疫反应、精神心理因素、遗传等[14-16]。制备良好的IBS动物模型是研究IBS发病机制、病理生理、药物治疗等方面的基础，制约了此类药物的研究和发展，而现有的文献报道的多数造模方法中，乳鼠母婴分离造模时间长且耗费大、死亡率高，外周致敏如肠道感染模型则不能很好模拟人类的IBS发病，唯有束缚应激联合其他刺激能更好得模拟人的IBS发病。慢性束缚应激过程为非损伤刺激且更接近人的心理应激，符合IBS的发病机制。本研究通过考察饲料中的乳糖添加量、束缚时间和造模持续时间对IBS-D大鼠模型的影响，以疼痛阈值评价其内脏敏感性，以腹泻指数评价其腹泻程度，并以空肠平滑肌运动波振幅和频率评价其胃肠动力。结果显示，四种造模方式均可导致动物于7 ～ 14 d内发生腹泻状态；而当乳糖比例为45%时，其容量阈值发生显著降低，表明其发生典型的内脏高敏感性症状；对于在体平滑肌运动频率和振幅的考察中发现束缚0.5 h并不能改变动物胃肠应激节律。鉴于这几方面因素的综合考察，本课题组认为当饲料中乳糖比例高于30%，束缚时间在1 h以上时，造模动物在7 ～ 14 d发生典型IBS-D的胃肠动力异常，以及出现内脏高敏感状态。