慢性铝中毒小鼠学习记忆与大脑皮层ACh、β-EP、SOD及MDA关系的研究

莫颂轶，张丽凤，黄彦峰，余双全，廖素婵，黄永毅，梁祚仁，黎 昀，蒋敏丽，黄俊杰

(右江民族医学院应用生理研究室，广西 百色 533000)

由于铝在各领域的广泛应用，人类在日常生活中接触铝制品的日益增多，铝可被摄取、吸收并在全身组织器官中分布[1-2]。铝是一种慢性神经毒性物质，脑是铝的蓄积部位和主要靶器官，铝可通过血脑屏障进入脑组织产生神经行为毒性作用，神经细胞对于铝的毒性十分敏感，长期铝暴露可导致人的认知能力和智力下降[3-4]。铝暴露所导致的神经系统损害已成为全球性公共卫生问题，然而慢性铝中毒如何影响学习和记忆的机制尚未完全阐明，造成了慢性铝中毒防治的困难。为此，本实验通过建立慢性铝中毒小鼠动物模型，测试小鼠的学习和记忆能力，以及测定大脑皮层乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)含量、β-内啡肽(β-endorphin，β-EP)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，研究慢性铝中毒小鼠学习记忆的影响与大脑皮层ACh、β-EP、SOD和MDA的关系，探讨铝中毒小鼠导致认知能力障碍的机制，为慢性铝中毒的预防提供理论基础和实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级KM小鼠32只，雌雄各半，3月龄，小鼠体重20 ～ 22 g，由右江民族医学院提供[SCXK (桂) 2017-0003]。小鼠饲养于右江民族医学院实验动物中心[SYXK (桂) 2017-0004]，饲养环境：室温(23±2)℃，相对湿度为40% ～ 60%，自由进水。小鼠的组织取材于右江民族医学院应用生理研究室进行。

1.2 主要试剂与仪器

三氯化铝(AlCl3)(天津市大茂化学试剂厂)；小鼠β-内啡肽试剂盒购于Sigma公司；SOD试剂盒、MDA试剂盒、ACh试剂盒和考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。UV-1700紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，FSH-2可调高速匀浆机(江苏省金坛市宏华仪器厂)，Y型迷宫刺激器(MG-B，张家港市教学实验器械厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组和铝中毒模型建立[5-6]

32只KM小鼠，随机分为四组，分别是正常对照组、低剂量铝中毒组、中剂量铝中毒组、高剂量铝中毒组，每组均为8只小鼠，各组小鼠雌雄各半，雌雄分笼饲养。正常对照组普通饲料饲养三个月；各剂量铝中毒组均用16 g/L浓度的AlCl3水溶液拌入饲料中喂养小鼠，低剂量铝中毒组每天按1.2 mg/kg体重剂量、中剂量铝中毒组每天按12 mg/kg体重剂量、高剂量铝中毒组每天按120 mg/kg体重剂量喂养小鼠，每天先喂完拌有AlCl3的饲料后再喂普通饲料，保证各组铝的摄入量，各剂量铝中毒组连续摄入铝三个月。本研究所涉及的动物实验均经过右江民族医学院伦理委员会批准，并严格执行实验动物安全制度及相关规章。实验过程中按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

1.3.2 小鼠学习记忆能力测试

各组小鼠的学习和记忆行为能力用Y型迷宫刺激器进行检测。按文献[7-8]的实验方法和学会标准，将小鼠达到学会标准时所需的测试次数，作为大鼠学习行为能力的检测指标。学习能力检测24 h后，依照上述方法对小鼠连续进行20次测试，记录小鼠在20次测试中的错误次数，作为小鼠记忆行为能力的检测指标。

1.3.3 小鼠大脑皮层ACh、β-EP、SOD和MDA含量测定

各组小鼠在三个月后断头处死取出脑组织，快速剥离出大脑皮层，用生理盐水制作成10%的匀浆，取匀浆的上清液分别测定大脑皮层中ACh含量、β-EP含量、SOD活性和MDA含量，各指标的测试步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 慢性铝中毒小鼠学习和记忆测试结果

单因素方差分析显示，各组间小鼠学习测试次数和记忆错误次数差异均有显著性(分别为F=18.96，P< 0.01；F=25.99，P< 0.01)。中剂量、高剂量铝中毒组小鼠学习测试次数比对照组均明显增多，中剂量、高剂量铝中毒组小鼠学习测试次数比低剂量组也明显增多；低剂量、中剂量、高剂量铝中毒组小鼠记忆错误次数比对照组均明显增多，中剂量、高剂量铝中毒组小鼠记忆错误次数比低剂量组也明显增多；差异均有显著性(P< 0.05或P< 0.01)。详见表1。

表1 慢性铝中毒小鼠学习和记忆测试结果Table 1 Learning and memory abilities of mice with chronic aluminum toxicities

注：与对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01；与低剂量组比较，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the low-dose group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

2.2 慢性铝中毒小鼠大脑皮层中ACh和β-EP含量

单因素方差分析显示，各组间小鼠大脑皮层ACh和β-EP含量差异均有显著性(分别为F=10.05，P< 0.01；F=6.53，P< 0.01)。中剂量、高剂量铝中毒组小鼠大脑皮层ACh含量比对照组明显降低，高剂量铝中毒组小鼠大脑皮层ACh含量比低剂量组也明显降低；低、中、高剂量铝中毒组小鼠大脑皮层β-EP含量比对照组明显降低，高剂量铝中毒组小鼠大脑皮层β-EP含量比低剂量组明显降低；差异均有显著性(P< 0.05或P< 0.01)。详见表2。

表2 慢性铝中毒小鼠大脑皮层中ACh和β-EP含量测定结果Table 2 ACh and β-EP levels in the cerebral cortex of mice with chronic aluminum toxicities

注：与对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01；与低剂量组比较，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the low-dose group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

2.3 慢性铝中毒小鼠大脑皮层中SOD活性和MDA含量的测定结果

单因素方差分析显示，各组间大脑皮层SOD活性和MDA含量差异均有显著性(分别为F=10.60，P< 0.01；F=7.16，P=0.01)。与对照组相比较，中剂量、高剂量铝中毒组小鼠大脑皮层SOD活性均明显降低，而中剂量、高剂量铝中毒组小鼠大脑皮层MDA含量均升高，差异均有显著性(P< 0.01或P< 0.05)；与低剂量组相比较，中剂量、高剂量铝中毒组小鼠大脑皮层SOD活性均降低，而高剂量铝中毒组小鼠大脑皮层MDA含量升高，差异有显著性(P< 0.01或P< 0.05)。详见表3。

表3 慢性铝中毒小鼠大脑皮层中SOD活性和MDA含量的测定结果Table 3 SOD and MDA levels in the cerebral cortex of mice with chronic aluminum toxicities

注：与对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01；与低剂量组比较，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the low-dose group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

2.4 慢性铝中毒小鼠学习和记忆与大脑皮层神经递质及自由基的相关性分析

Pearson相关性分析显示，中剂量、高剂量铝中毒组小鼠大脑皮层中ACh、β-EP和SOD均与相应同剂量组学习测试次数和记忆错误次数均呈负相关(P< 0.05或P< 0.01)；高剂量铝中毒组小鼠大脑皮层中MDA含量与同剂量组学习测试次数和记忆错误次数均呈正相关(P< 0.05或P< 0.01)。详见表4。

表4 慢性铝中毒小鼠学习和记忆与大脑皮层神经递质及自由基的相关性分析(n=8)Table 4 Correlation analysis between learning and memory abilities and the levels of ACh, β-EP, SOD, and MDA in the cerebral cortex of mice with chronic aluminum toxicities

3 讨论

学习与记忆是两个有联系的神经活动过程，是动物和人类中枢神经系统的高级功能活动。迄今为止，有关学习和记忆的机制仍不十分清楚。已有研究表明，学习和记忆力与神经系统中的神经递质乙酰胆碱密切相关[9-12]，脑内乙酰胆碱有促进学习和记忆的作用；阿片肽是神经肽的主要成员，内啡肽属于阿片肽中的一族，内啡肽中主要是β-内啡肽，有研究报道，β-内啡肽可易化记忆[13 -14]，其作用与给药剂量和给药时间呈明显相关性，但也有人认为β-内啡肽可损害记忆能力[15]。

本研究结果发现，各剂量铝中毒组小鼠学习训练次数和记忆错误次数均高于正常对照组，且学习训练次数和记忆错误次数增多的幅度随着铝中毒剂量的增高而增多，这说明慢性铝中毒可致小鼠学习和记忆能力下降，这与文献报道[4, 16]一致。本研究结果还显示，各剂量铝中毒组小鼠学习测试次数和记忆错误次数增加的同时，其大脑皮层乙酰胆碱和β-内啡肽的含量反而明显低于对照组，且小鼠学习记忆能力明显下降，大脑皮层乙酰胆碱和β-内啡肽也随之明显降低，呈现了一定的剂量效应关系；通过Pearson相关性分析显示，中、高剂量铝中毒组小鼠大脑皮层中乙酰胆碱和β-内啡肽均与相应同剂量组学习测试次数、记忆错误次数均呈负相关，这说明大脑皮层中乙酰胆碱和β-内啡肽参与学习和记忆的神经递质，大脑皮层中乙酰胆碱和β-内啡肽均有促进学习和记忆的作用，与文献报道[12-13]一致。

超氧化物歧化酶(SOD)是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶，在保护细胞免受氧自由基的毒害中发挥着重要作用；自由基攻击膜脂中的不饱和脂肪酸，使其发生氧化，脂质过氧化产物丙二醛(MDA)就会升高。本研究结果表明，中、高剂量铝中毒组大脑皮层SOD活性均明显降低，而中、高剂量铝中毒组大脑皮层MDA含量均升高；高剂量组小鼠大脑皮层中SOD与学习测试次数和记忆错误次数均呈负相关；而MDA含量与学习测试次数和记忆错误次数呈正相关。慢性铝中毒使铝在体内脑、骨、肝等多个组织器官中蓄积，特别铝可以通过血脑屏障进入脑组织产生神经行为毒性作用[17-18]。进入脑组织内的铝可引起大脑皮层脂质过氧化增强和产生自由基增多[19-20]，氧自由基引起的DNA损伤可激活p53基因，氧自由基的氧化应激可活化核转录因子NF-kB和Caspase基因家族等途径，可加速细胞凋亡相关基因的表达，引起神经细胞凋亡。因此，铝中毒后导致小鼠神经细胞凋亡增加，从而使小鼠学习记忆受到损伤[21-22]。

综上所述，不同剂量铝中毒可引起小鼠认知功能障碍，铝中毒可能通过降低大脑皮层中乙酰胆碱、β-内啡肽和SOD含量，升高MDA含量，进而影响小鼠学习与记忆能力，这可能是铝中毒致小鼠认知能力障碍的机制之一。但其具体的机制还有待于进一步研究和探讨。