营养元素和蛋白联合干预氟中毒对雌鼠卵巢功能作用

王飞清，夏曙华，邹文兵，杨 华，喻茂娟

(1.贵阳中医学院第一附属医院检验科，贵阳 550001； 2.贵州医科大学附属乌当医院检验科，贵阳 550018； 3.贵航300医院检验科，贵阳 550002； 4.贵州医科大学公共卫生学院，贵阳 550004)

地方性氟中毒(地氟病)是由于长期摄入过量氟而引起的，根据氟源和人体摄氟的不同途径，大体上可分为饮水型、燃煤污染型、饮茶型三种。燃煤型氟中毒是中国特有的一种氟中毒，其中贵州为受灾严重地区之一。其发病的主要原因是机体摄氟量水平，营养因素和摄氟量之间存在一种叠加效应，氟中毒患病率与营养水平的高低有着密切关系。流行病学报道，除机体高氟直接摄入的危害外，饮食中维生素、蛋白质及矿物质的摄入量不足可加重氟中毒的危害和流行程度。实验研究发现，蛋白质、矿物质元素等能改善机体营养，提高机体的抗氟抗病能力，减轻氟中毒对牙齿的损害[1]。本课题组前期研究发现燃煤型氟中毒可影响雌鼠动情周期、性激素分泌、促进卵泡闭锁[2-4]。目前对于氟中毒致雌性生殖系统功能的临床防治干预还未得到足够的关注，给予营养成分和蛋白饮食是否能拮抗氟中毒对雌鼠卵巢生殖功能毒性研究非常缺乏。通过相关的理论依据，本课题设计以SD雌性大鼠为研究对象，构建雌鼠燃煤型氟中毒动物模型并对其同时添加营养元素和蛋白干预。通过拮抗后，观察SD雌鼠氟斑牙、尿氟、骨氟、体重变化、各级卵泡、闭锁卵泡以及黄体数量和形态变化，凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达量。探究钙、镁、铜、锌、维生素D和蛋白对燃煤型氟中毒雌性生殖系统毒性损伤的干预，解析其对燃煤型氟中毒雌性生殖系统毒性损伤干预的机制，为促进对高氟区女性的生殖健康和生殖内分泌系统影响的防治干预研究奠定一定的基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

以120只断乳2周体重80 g左右的清洁级SD雌性大鼠为研究对象，由贵州医科大学动物实验中心提供[SCXK (黔) 2012-0001]。贵州医科大学动物实验中心动物实验室环境温度20℃ ～ 25℃，湿度(60±20)%，正常明暗交替[SYXK (黔) 2012-0001]。

1.2 主要仪器与试剂

Bcl-2和Bax试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；氟化钠(优质纯，成都金山化学试剂有限公司)；营养元素组合片由惠氏制药有限公司提供。青岛海尔集团产海尔-20℃冰箱(BCD-539WE)；奥林巴斯光学工业株式会社生产Olympus双目光学显微镜；德国Leica公司产EG1150石蜡包埋机；德国Leica公司产Leica RM2135型切片机。

1.3 实验方法

1.3.1 构建动物模型方法

雌鼠适应性喂养一周，无异常发现后，根据体重由小到大排序，按随机数表法分组、编号。随机分为4组：对照组、染氟组(100 mg/kg)、多种元素组(氟100 mg/kg +营养元素组合片2.08 g/kg)、多种元素+蛋白组(氟100 mg/kg +营养元素组合片2.08 g/kg +蛋白30%)，每组30只，每周调整鼠笼的位置，力求各组大鼠的实验条件一致。自由饮用自来水，各模型组大鼠自由食用不同配方的病区原煤加拌泥煤烘烤的玉米饲料。每天动态观察大鼠日常情况(毛色、饮水、食用饲料量等)，每周观察大鼠牙齿的变化并称重、记录数据。分别于染氟60，120，180 d处死，每次处死之前连续10 d每天早上(8:00 ～ 10:00)对雌鼠进行阴道脱落细胞涂片，观察动情周期变化，于动情期处死大鼠。本实验经贵州医科大学伦理委员会批准实施：1305020，亦经贵阳中医学院第一附属医院伦理委员会批准，符合动物伦理学要求。研究过程中按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

1.3.2 免疫组织化学法检测卵巢颗粒细胞Bcl-2和Bax蛋白

处死雌鼠后，迅速取其一侧卵巢，立即放入10%的中性福尔马林固定液中固定，待固定液浸透后，用锋利的刀片取大小1 mm左右的卵巢组织，石蜡包埋，常规切片，免疫组织化学法检测卵巢颗粒细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达情况。Bcl-2和Bax蛋白定位于细胞浆中，阳性细胞胞浆着色呈棕黄色，不显棕黄色者为阴性细胞。在高倍镜下，每张切片随机取5个视野，计算每个视野下100个细胞中阳性细胞百分比(阳性细胞数/总细胞数)。

1.3.3 HE染色观察卵巢组织形态学并记录各级卵泡

于实验60，120，180 d动情期股动脉取血处死雌鼠，立即取出卵巢剔除脏器周围脂肪和结缔组织，滤纸吸干表面血液，经10%甲醛溶液固定，每组取10只大鼠卵巢组织进行包埋做形态学。取材、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色。200倍镜下观察卵巢组织结构形态学，且每张切片随机选取20个高倍镜视野镜下计算原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、黄体卵泡、闭锁卵泡数量变化。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况与模型构建

阴性对照组雌鼠食欲正常，精神较好，毛色有光泽；模型组雌鼠食欲降低，活动减少，精神萎靡不振，毛色光泽度下降；随着时间延长多种元素组和多种元素+蛋白组雌鼠与对照组区别不大，但随染氟时间的延长染氟组表现加重。模型构建依据课题组前期文献报道氟斑牙、尿氟和骨氟检测[5-7]。

2.2 各组卵巢颗粒细胞Bcl-2和Bax蛋白表达情况

2.2.1 Bcl-2蛋白表达情况

各组间和各组内比较，雌鼠卵巢颗粒细胞Bcl-2蛋白表达量差异无显著性(P> 0.05)，结果见表1和图1。

2.2.2 Bax蛋白表达情况

相同时间比较(60，120，180 d)：60 d各模型组与对照组比较，雌鼠卵巢颗粒细胞Bax蛋白表达量差异均无显著性(P> 0.05)。120 d和180 d染氟组雌鼠卵巢颗粒细胞Bax蛋白表达量明显高于对照组、多种元素组和多种元素+蛋白组，差异均有显著性(P< 0.05)；多种元素+蛋白组比多种元素组Bax蛋白表达量低，且180 d比较差异有显著性(P< 0.05)。结果见表1和图2。

各组内比较，染氟组雌鼠卵巢颗粒细胞Bax蛋白表达量逐渐增多，60 d明显低于120 d、180 d，且差异均有显著性(P< 0.05)。多种元素组和多种元素+蛋白组Bax蛋白表达量逐渐增多，且多种元素组60 d与180 d比较，差异有显著性(P< 0.05)；多种元素+蛋白组组内之间表达差异无显著性(P> 0.05)，结果见表1和图2。

2.3 各组雌鼠卵泡及黄体的情况

对照组和各染氟组雌鼠卵巢外观色泽鲜红，光镜下卵巢组织结构形态正常，均可见多个黄体及不同发育阶段的卵泡，颗粒细胞呈单层或多层排列，排列整齐。染氟组随时间延长，卵巢颗粒细胞呈现渐进性水肿的变化，闭锁的卵泡和黄体退化逐渐增多，成熟卵泡明显减少。多种元素组随时间延长，卵巢颗粒细胞呈现轻中度水肿，闭锁的卵泡和黄体退化低于染氟组，可见成熟卵泡。多种元素+蛋白组随时间延长，卵巢颗粒细胞少见轻度水肿，闭锁的卵泡和黄体退化程度低于染氟组，可见成熟卵泡。见图3。

各组间雌鼠的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、黄体数量差异均无显著性(P> 0.05)。各组间雌鼠闭锁卵泡数量比较：60 d对照组、多种元素+蛋白组与染氟组比较，差异有显著性(P< 0.05)。120 d和180 d染氟组闭锁卵泡数量明显高于对照组、多种元素组、多种元素+蛋白组，差异有显著性(P< 0.05)。各时间点干预组与对照组比较，差异均无显著性(P> 0.05)。各组内比较，随时间延长，闭锁卵泡数量差异均无显著性(P> 0.05)。结果见表2。

表1 各组雌鼠Bcl-2和Bax蛋白表达量Table 1 Bcl-2 and Bax expression of the female rats in each group

注：相同时间组间比较，*P< 0.05；与多种元素组比较，△P< 0.05；相同剂量组间比较，◇P< 0.05；与180 d比较，○P< 0.05。

Note. Comparison among groups at the same time,*P< 0.05. Compared with the various elements group,△P< 0.05. Comparison among groups with the same dose,◇P< 0.05. Compared with 180 d,○P< 0.05.

注：A：对照组；B：染氟组；C：多种元素组；D：多种元素+蛋白组。图1 180 d雌鼠卵巢颗粒细胞Bcl-2表达(× 200)Note. A: Control group; B: Fluorosis group; C: Various elements group; D: Various elements + protein group.Figure 1 Bcl-2 expression in ovarian granulosa cells at 180 days in female rats

注：A：对照组；B：染氟组；C：多种元素组；D：多种元素+蛋白组。图2 180 d雌鼠卵巢颗粒细胞Bax表达(× 200)Note. A: Control group; B: Fluorosis group; C: Various elements group; D: Various elements + protein group.Figure 2 Bax expression in ovarian granulosa cells in 180 days in female rats

组别Groups天数(d)Days原始卵泡数量Number of primordial follicles初级卵泡数量Number of primary follicles次级卵泡数量Number of secondary follicles黄体数量Number of corpora lutea闭锁卵泡数量Number of follicle atresia对照组Control group6016.1±3.98.7±1.85.3±1.618.2±4.819.8±4.4*12016.7±2.87.3±2.15.6±1.722.2±4.619.2±3.9*18016.9±3.67.9±2.06.5±1.619.1±4.519.6±4.4*染氟组Fluorosis group6016.5±3.38.2±1.66.6±1.318.7±3.724.6±5.2 12015.9±3.18.3±1.55.9±1.319.6±3.325.4±4.118016.2±4.37.8±1.75.7±1.618.6±4.526.1±5.3多种元素组Various elements group6016.4±3.97.8±1.56.2±1.719.3±4.921.5±4.2 12017.4±3.07.4±2.26.2±1.820.8±4.520.6±3.3*18016.7±3.97.4±2.15.8±2.118.8±3.121.2±3.3*多种元素+蛋白组Various elements + protein group6017.2±2.79.2±1.65.8±1.819.1±3.820.4±4.2*12016.3±3.08.2±2.15.6±2.121.6±3.519.2±3.1*18016.6±3.08.8±2.16.4±1.919.7±3.720.9±4.3*

注：与染氟组比较，*P< 0.05。

Note. Compared with the fluorosis group,*P< 0.05.

注：A：对照组；B：染氟组；C：多种元素组；D：多种元素+蛋白组。图3 180 d雌鼠卵巢组织形态(× 200)Note. A: Control group; B: Fluorosis group; C: Various elements group; D: Various elements + protein group.Figure 3 Ovarian tissue morphology at 180 days in female rats

3 讨论

实验研究发现，氟中毒可引起凋亡蛋白表达增高，促进细胞凋亡发生[8]。而钙、镁、铜、锌很早已被人们作为拮抗氟中毒的主要营养元素之一，科提高机体抗氧化力，拮抗氟对机体毒性损伤和细胞凋亡[9-10]。文献报告，锌和铜可增加男性生殖细胞对氧化应激的耐受性，降低生精细胞的凋亡[11]。钙、镁、铜等参与机体抗氧化酶合成同时，可降低凋亡蛋白Bax的表达，这已在神经元和雄性精子的抗氟抗氧化损伤作用得到实验论证[12-13]。本实验结果显示，两干预组Bcl-2蛋白表达量与对照组相比无明显差异，与染氟组比较有所升高，但差异无显著性，表明染氟和营养因素对蛋白Bcl-2表达量影响不大。实验结果进一步显示，染氟组Bax蛋白表达量明显增加，而添加营养成分干预，两干预组Bax蛋白表达量与染氟组比较明显降低。两干预组间比较，Bax蛋白表达差异无显著性。通过干预，两干预组Bax蛋白表达量与对照组比较差异无显著性，显示钙、镁、铜、锌、维生素D和蛋白可降低氟中毒卵巢颗粒细胞Bax蛋白表达。本实验初步探讨氟对雌性生殖系统毒性机制和干预情况，为今后对氟病区女性生殖毒性防治和治疗起到重要意义。

卵泡退化主要因素与卵巢颗粒细胞的凋亡密切相关[14]。本实验结果显示，高剂量氟可促进卵巢颗粒细胞的凋亡，且光镜结果显示闭锁卵泡和退化黄体增多，这与本实验组前期报到高氟对卵巢损伤相符[15]。实验研究报道，卵巢颗粒细胞和卵泡膜细胞分布丰富维生素D受体，给予维生素D可调节卵巢功能[16]。本实验结果显示，两干预组与对照组比较，原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡及黄体数量均未产生明显的影响。多种元素组和多种元素+蛋白组卵巢颗粒细胞少见轻度水肿，正常的各级卵泡多见，闭锁的卵泡和退化的黄体明显低于染氟组，且从形态学比较两干预组效果差异不明显。结果还发现，两干预组与对照组比较闭锁卵泡数量无明显差异，与染氟组比较逐渐降低，差异有显著性，显示钙、镁、铜、锌、维生素D和蛋白可拮抗氟对卵泡细胞毒性作用，两干预组间卵巢组织形态和卵泡数量无明显差异，提示与干预时间长短和干预因素无明显相关性，这与本课题组前期研究报道卵巢颗粒细胞超微结构的改变相符[17]。

综上所述，本研究显示高剂量的氟对雌鼠卵巢生殖功能存在明显毒性作用，表现为卵巢颗粒细胞促凋亡蛋白Bax表达明显增高，光镜下卵巢颗粒细胞明显水肿、闭锁卵泡增加、黄体退化，明显影响卵泡发育。添加钙、镁、铜、锌、维生素D和蛋白干预氟中毒对卵巢组织毒性作用，结果显示上述干预因素可使染氟所致卵巢颗粒细胞促凋亡蛋白Bax表达显著降低，光镜下闭锁卵泡的数量明显降低，各阶段发育卵泡可见；在添加钙、镁、铜、锌、维生素D基础上加入蛋白，可使雌鼠卵巢颗粒细胞凋亡蛋白Bax表达和闭锁卵泡数量降低，且随干预时间延长，效果更佳。