犬卵母细胞体内发育及体外成熟的研究进展

曹满园，张宇飞，王丽英，曹俊国，李文，韩玉萍，许保增※，王守富

（1.中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室，长春 130112；2.吉林农业大学，长春 130118）

犬科动物多为季节性、单次发情动物，但经驯养的家犬，其季节性发情特点逐渐消失，全年均可出现发情，尤其春、秋季节的发情比例较高[1]。犬的乏情期长[2]，平均可达到6～9 个月，有些犬科动物乏情期甚至能达11 个月之久[1]。与其他哺乳动物相比，犬的生殖生理具有特异性，犬卵母细胞所处的卵泡液中含有高达1 000 倍血浆浓度的孕酮[3]，犬排卵时卵母细胞处于生发泡（Germinal vesicle，GV）期，在输卵管中恢复与完成减数分裂[4]。人以及其他许多哺乳动物可以通过人工授精（Artificial insemination，AI）、卵母细胞体外成熟（In vitro maturation，IVM）、体外受精（In vitro fertilization，IVF）和胚胎移植（Embryo transplantation，ET）等人工辅助生殖技术（Assisted reproductive technology,ART）获得子代[1]。据报道，犬卵母细胞发育到MII 期的平均率通常在10%～20%左右，且卵母细胞的IVM率低，辅助生殖研究进展缓慢，制约了犬相关生物技术的发展与运用[5]。本文根据近几年犬相关研究数据，综述了犬卵母细胞体内发育及体外成熟的研究进展。

1 犬卵母细胞的体内成熟

在体内，卵泡及输卵管为犬卵母细胞的成熟提供了条件和因子，且犬卵母细胞与其周围的颗粒细胞、输卵管上皮细胞以及精子之间有着结构和功能上的联系[6]，这些细胞及其相关因子调节着卵母细胞的生长与成熟。

1.1 卵泡发育

卵泡是卵巢结构和功能的基本单位，哺乳动物卵母细胞通常在卵泡中发育成熟，但犬卵母细胞的最后成熟是在卵泡外完成的。犬卵泡发育（从原始卵泡到排卵）需要170 d，最终的卵泡生长是在排卵前60～100 d 的休情期期间开始的[7]。发情初期，卵泡直径1.0～1.5 mm，促黄体素（luteinizing hormone，LH）峰时达到2.0～6.5 mm（平均3.5 mm），排卵时卵泡直径为6.0～8.0 mm[5]。犬卵泡后期生长表现出的特异性之一是对促性腺激素的接受能力，与其他哺乳动物相比，犬卵泡在颗粒层能非常早地获得LH 受体，当犬卵泡直径达到800m，亦即达到排卵卵泡直径的25%时就能检测到LH 的结合位点，而其他物种通常在达到排卵直径的50%时才可检测到[5]。犬卵泡后期生长的另一个特点是早期黄体化。

犬卵泡发育的特征是多卵卵泡（Multi-oocytic follicles，MOF）的高发生率，在小的生长卵泡中，5%～14%（甚至40%）包含2～17 个卵母细胞[5]。由于输卵管中收集到的卵母细胞数量有时高于卵巢表面黄体的数量，研究者认为MOF 确实可以排卵。尽管如此，即使MOF能够排出多个卵母细胞，仍需证实它们是否具有成熟和受精能力。在MOF 内收集的各种卵丘-卵母细胞复合物（Cumulus-oocyte complexes，COCs）的形态和粘液化评分有很大差异，这表明每个多卵卵泡中都包含一个高质量的单一卵母细胞[5,8]。

犬主要的生殖特性是排卵时释放GV 期卵母细胞。另外，排卵后卵母细胞不能立即恢复减数分裂。大多数哺乳动物在排卵前几小时，LH峰诱发卵丘粘液化和卵母细胞减数分裂（从GV 期到MII 期）。与其他哺乳动物相比，LH 峰的功能在犬上表现出更多的不同，LH 峰值持续24～72 h，LH 峰值和排卵之间的延迟大约在36～50 h[5]。

与其他哺乳动物一样，犬科动物COCs 的粘液化发生在LH 峰后不久，即在卵泡直径为4.0～4.5 mm 时可获得粘液化能力。这种粘液化的一个特点是与卵母细胞紧密接触的2～3 层颗粒细胞在排卵后2～3 d内仍不会粘液化[5]。这表明，卵丘细胞在犬卵母细胞晚期减数分裂恢复中发挥重要作用。

1.2 排卵

确定排卵的确切时间是确保卵母细胞和胚胎生物学准确性的关键步骤。在犬中，使用阴道涂片法、血液LH检测（或孕酮检测）法、超声波检测法等均可以判断犬是否排卵，但超声波诊断是目前最为常用的检测方法。

排卵时，卵母细胞连同2～3 mL 卵泡液排到输卵管伞中。排卵后44 h，卵母细胞位于输卵管的近中部，但仍处于GV 期。从排卵后48 h 开始，卵母细胞恢复减数分裂。此时，可观察到MI 期卵母细胞，第一个完全成熟的MII 期卵母细胞大约在排卵后48～54 h 出现。此阶段，卵母细胞具有受精能力，未成熟的卵母细胞在犬体内也具备受精能力，但比例很低。在排卵后92～127 h 可观察到一些退化的MII 期卵母细胞在排卵后7 d，一些卵母细胞被证明仍具有受精能力。排卵后的第9 d，受精能力丧失[5]。

有报道表明，在哺乳动物减数分裂的传统模型中，颗粒细胞通过横向突起在卵母细胞的细胞质中维持高浓度cAMP 直至LH 峰，高浓度cAMP 致使DNA 发生去凝缩（即抑制减数分裂恢复）[8]。LH 峰后，突起缩回，卵母细胞内的cAMP 浓度下降，使得减数分裂得以恢复[5-9]。LH 峰后卵丘细胞与卵母细胞膜的解偶联触发减数分裂的恢复。在犬COCs 中，放射冠中的细胞通过透明带发出连接到达卵母细胞膜，卵母细胞膜甚至可以内陷达到细胞核附近[10]。经观察，这些细胞在排卵后2～3 d 仍然牢固地附着于透明带；在超微水平下，横向突起排卵后2 d 开始退化，在排卵后3 d 完全消失。当卵母细胞在体外培养过程中自发脱落时，减数分裂恢复和中期比率增加。因此，犬与其他哺乳动物一样，颗粒细胞在其恢复减数分裂的过程中发挥核心作用，但不是以cAMP 作为主要介质，因为在体外中期率的增加不是因为培养液中加入了蛋白激酶A抑制剂RpAMPc 或cAMP 类似物-二丁酰基；在减数分裂恢复的过程中，犬血液中孕酮浓度显著增高（10～20 ng/mL）[5]，推测孕酮可能在犬卵母细胞核成熟过程中发挥重要作用。而另一些研究表明，孕酮在犬卵母细胞减数分裂恢复过程中不发挥作用，因为在IVM 培养基中添加孕酮后没有出现减数分裂完成率增加的现象。因此，应进一步研究孕酮对犬卵母细胞成熟的作用。减数分裂恢复的延迟可能是由于犬卵母细胞细胞质中缺乏某些因子，要么是在输卵管液中发现的因子，要么是卵母细胞自身合成的因子。与其他哺乳动物一样，在排卵过程中，犬卵母细胞无转录活性。已证明，与转录激活相关的核仁结构在排卵后27～33 h 之间发生了重构。在减数分裂之前激活基因，对于更好地理解犬卵母细胞减数分裂的机制是非常重要的[5]。

2 体外成熟

胚胎移植（ET）、体外受精（IVF）以及辅助生殖（ART）等犬繁殖相关技术较其他哺乳动物而言发展缓慢[11]，主要是因为犬的生殖生理与其他动物相比具有特异性。王伦学等[12]研究发现，犬卵母细胞的体外成熟率较低，犬卵巢排出的卵母细胞处于GV期，减数分裂的恢复发生在输卵管中。研究还发现，有0%～58%的犬卵母细胞可以恢复减数分裂，而平均约20%的卵母细胞能发育至MII 期。试验或是生产过程中，胚胎移植和体外受精等都需要大量成熟卵母细胞。而犬卵母细胞的质量对其体外成熟及核移植后的胚胎发育影响较大[13]。由于犬卵母细胞体外成熟机理的特异性，其体外成熟体系与其它家畜相比仍有待完善。目前，犬卵母细胞体外成熟的培养液多借鉴于其它动物，很少或是没有考虑到犬的种属特异性[12]。目前，已有较多的研究尝试从多个方面对影响犬卵母细胞体外成熟的因素进行探讨，以完善其体外培养系统，提高犬卵母细胞体外成熟效率。

2.1 影响因素

2.1.1 卵母细胞自身形态与体外成熟的关系 犬与其他哺乳动物一样，卵母细胞的成熟与细胞直径有关，因此选择大小合适的犬卵母细胞做试验材料，对其体外成熟的研究极为重要[14]。Hewitt 等[15]发现，直径＞100m的卵母细胞成熟能力大于直径＜100m的卵母细胞。T Otoi 等[16]的试验发现，卵母细胞的减数分裂能力与其直径大小成正比；直径＜110m 的卵母细胞发育达不到MⅡ期，而卵母细胞直径一旦达到120m 就能获得减数分裂能力。这标志着犬卵母细胞的直径可作为衡量IVM 效率的一个重要指标[12]。

Metcalfe S S 等[17]发现，犬卵巢中约20%～68%的卵母细胞会发生形态退化，严重影响犬卵母细胞的体外成熟。Farstad W 等[18]的研究表明，卵母细胞数量和质量是制约犬卵母细胞体外成熟的重要因素之一。因此，犬卵母细胞体外成熟试验应该选择大量的较高质量的卵母细胞。

2.1.2 供体对卵母细胞体外成熟的影响 有关供体犬卵母细胞的体外成熟能力与供体的年龄及其采集卵母细胞时犬所处的生殖生理阶段之间的关系的研究结果报道不一致[19]。Hewvit 等[15]通过体外培养不同年龄的供体犬的卵母细胞并监测它们的核成熟，结果表明，从特定大小的卵泡中采集的卵母细胞才有能力获得体外成熟；通过比较1～6 岁组和7 岁及其以上年龄组的犬卵母细胞体外成熟能力时发现，6 岁以下供体犬卵母细胞在体外培养成熟的潜力更高，随着年龄增大，卵巢组织会严重老化，卵母细胞获取数量及质量也会随之降低，减数分裂能力减小[1,15]。Rodirgues等[20]发现，犬卵母细胞的体外成熟不受供体犬生殖阶段的影响。更多的研究认为，生殖周期是影响犬卵母细胞体外成熟的关键因素之一，发情期供体犬的卵巢获得的卵母细胞体外成熟能力更强，可能与卵泡内含有高浓度的雌激素、孕酮及一些未知因子有关。Luvoni GC 等[21]发现，卵泡期犬卵母细胞恢复减数分裂和达到MI 期、MII 期的能力高于乏情期。Yamada 等[22]的研究发现，虽然生殖周期对犬卵母细胞体外成熟有一定的影响，但并不是关键因素之一。Evecen 等[23]采集了储存在不同温度（4℃和37℃）的乏情期、发情期和黄体期卵巢的卵母细胞，培养在相同的环境条件下。结果发现，卵巢储存在37℃的情况下，发情期和黄体期组卵巢的卵母细胞体外成熟率要高于乏情期组；卵巢储存在4℃的情况下，乏情期组卵巢的卵母细胞体外成熟率要高于黄体期组；另外，乏情期组卵巢储存在4℃的情况下其卵母细胞体外成熟率要高于其储存在37℃的情况下，但是，发情期和黄体期组卵巢的卵母细胞在4℃和37℃的储存情况下其体外成熟率无显著差异。因此，该试验的结果显示，卵巢储存温度-发情周期的交互作用也影响了卵母细胞成熟率。

2.1.3 卵丘细胞与体外成熟的关系 卵母细胞成熟是当前动物生物技术的关键问题。为了提高犬卵母细胞体外成熟率，研究者通过验证发现，卵母细胞的体积、胞质颜色等对核体外成熟有一定的影响。Otoi 等[24]的研究发现，直径＜100m 的卵丘卵母细胞成熟率仅为4% ～10%。Songsasen 等[25]发现，仅有一层颗粒细胞的犬卵母细胞培养至48 h 后发生退化。卵丘细胞与卵母细胞紧密连接形成COCs，卵丘细胞与卵母细胞间发生着复杂的信号传递，从而对卵母细胞的发育实现分子水平的调控[3]。卵丘细胞扩展在犬上表现出特殊性[12]。Rodrigues 等[26]研究发现，犬卵母细胞体外成熟时卵丘细胞很少发生扩展。多数研究者发现，犬卵丘细胞扩展与其卵母细胞的体外成熟不成正比关系[27]。N Songsasen 等[28]发现，GH能刺激犬卵母细胞中卵丘扩展，但对于提高犬卵母细胞体外成熟率影响不大。不同研究结果的出现可能与生长因子对犬科动物卵母细胞及卵丘细胞的影响不同有关[12]。

2.1.4 培养条件对体外成熟的影响 犬在GV 期排卵，经过48～72 h 在输卵管远端成熟。由于与其他家养哺乳动物的这些差异，犬卵母细胞IVM的效率非常低。研究显示，不同的培养基对犬卵母细胞成熟率的影响差异显著。N Songsasen 等[28]的研究表明，犬卵母细胞在无蛋白培养基中能完成核体外成熟。Oh HJ等[29]研究不同发情期犬血清对从不同生殖状态（卵泡，黄体或衰老期）卵巢中获得的犬卵母细胞体外成熟的作用，研究表明，用10%犬发情血清补充培养基可改善犬卵母细胞的体外成熟。另外，犬卵母细胞对卵巢储存温度以及卵母细胞培养温度非常敏感。潘和平等[30]在兰州土狗卵丘-卵母细胞复合体的颗粒细胞扩展时研究发现，卵丘-卵母细胞复合体体外培养在37.0℃组要好于在36.5 ℃组。HSLEE 等[31]将犬卵巢分别储存在4 ℃和38 ℃5 h 后采集不同储存温度的卵母细胞，并分别将其培养在38℃温度条件下培养，观察其在不同培养时间体外培养的卵母细胞的活性，结果发现，4 ℃组和38 ℃组的卵母细胞活力在0～4 h 之间差异不显著（活力分别为79.6%和83.9%），但在24 h 和48 h后卵母细胞的活力有显著差异（24 h 分别为13.2%和77.8%；48 h 分别为0%和72.9%）。

2.1.5 其他因子对体外成熟的影响 向培养体系中补充一些因子或是某些激素对卵母细胞体外成熟有一定的作用。人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotroin，hCG）在犬卵母细胞减数分裂恢复过程中的作用显著，Monica 等[32]在体外分段培养的前48 h（总培养时间为96 h）添加适量hCG，与对照组相比，卵母细胞的体外成熟率明显增高。有研究表明，在培养体系中添加适宜浓度的雌激素或孕激素对提高犬卵母细胞的体外成熟率有显著的影响[33]。N Songsasen 等[25]研究发现，减数分裂抑制剂Roscovitine 对犬卵母细胞减数分裂的抑制能力不显著，同时发现，dbcAMP能够显著抑制犬卵母细胞减数分裂恢复能力。在IVM 培养基中补充-巯基乙醇（ -mercaptoethanol，-ME）和表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）可以改善IVF 后卵母细胞的体外成熟和胚胎发育[12,34]。这两种化合物的作用被认为是通过合成谷胱甘肽（GSH）来介导的，GSH 在保护细胞或胚胎免受氧化损伤方面发挥重要作用。KimMK等[34]在犬卵母细胞体外成熟研究试验中向犬卵母细胞IVM 培养基中补充 -ME 或EGF，结果发现，用25mol/L 或100mol/L 的 -ME 培养的卵母细胞发育至MI 期能力显著增加，与其他实验组相比，添加50mol/L 或100mol/L -ME 培养的卵母细胞发育至MII 期能力显著增加。另外，20 ng/mL EGF 能显著促进卵泡期犬卵母细胞发育至MII 期的能力[34]。

2.2 培养体系

由于犬科动物生殖生理的特异性，目前已报道的犬、银狐等犬科动物卵母细胞的体外培养方法多采用细胞共培养、卵泡培养、液滴培养以及在游离输卵管中培养。

2.2.1 细胞共培养 细胞共培养包括胚胎成纤维细胞共培养、颗粒细胞共培养和输卵管上皮细胞共培养[1]。Hatoya S 等[35]利用MEF 和CEF 对犬卵母细胞的IVM、IVF和IVC的影响研究发现，胚胎成纤维细胞的共培养能增强犬卵母细胞细胞核和细胞质成熟。有研究发现，颗粒细胞对犬卵母细胞的体外成熟有一定促进作用[12]。Digbo Bolamba 等[36]使用人工合成输卵管液（SOF）培养基对来自腔前卵泡的卵母细胞体外成熟能力进行评估，其研究结果表明，在培养基中补充4%牛血清蛋白（BSA）能显著促进犬卵母细胞核成熟。一些研究者将输卵管上皮细胞与犬卵母细胞共培养时发现，卵母细胞成熟率明显增高，但其对IVF 后的胚胎发育无明显作用[1]。另外，研究指出，采集试验所需的输卵管上皮细胞的供体母犬生殖周期及采集部位对试验结果有一定的影响[1]。

2.2.2 卵泡培养 Bolamba D 等[37]指出，大部分家养犬的晚期腔前卵泡（APAN）和早期有腔卵泡（EAN）含有具有体外发育成熟能力的卵母细胞，且这些卵母细胞已经获得了排卵前卵母细胞致密的胞质脂质特征。将APAN 和EAN 卵泡通过胶原酶和DNA 酶处理从卵巢分离后置于培养基中分别培养0h、24 h、48 h、72 h。结果显示，培养24 h 后，来自APAN 滤泡的卵母细胞能显著地达到MI 至MII 期（5.3%），与在0 h 观察到的对照滤泡的百分比（0.9%）差异显著[37]。继续培养至48 h 达到MI 至MII 期的卵母细胞百分比进一步增加（11.5%），培养至72 h 时发育率保持不变；培养24 h后，EAN 滤泡中达到MI 至MII 期的卵母细胞的百分比与对照组比没有显著增加，培养48 h 后发育率增加（8.7%），培养72 h 后发育率保持不变[37]。研究证明，早期卵泡内的犬卵母细胞能够恢复减数分裂到中期阶段。

2.2.3 液滴培养 液滴培养是卵母细胞体外成熟试验中最常用的培养体系，即在适宜的温度和湿度下，将分离得到的COCs 放在用矿物油覆盖的培养液滴中培养，其关键影响因素在于培养COCs 的密度[1]。Otoi T等[38]对卵母细胞与培养基的适宜比例进行了研究，将不同数量的COCs 在100L 成熟培养基中培养72 h，结果发现，来自乏情期卵巢的卵母细胞的减数分裂能力受培养的COCs 的密度影响较大，而来自发情期卵巢的卵母细胞的减数分裂能力受培养的COCs的密度影响较小。

2.2.4 在游离输卵管中培养 Luvoni GC等[39]将采集的犬卵母细胞在输卵管峡部-壶腹部中置于培养液中培养，试验结果表明，培养30 h，结扎输卵管组的卵母细胞恢复减数分裂的比例（63.8%）高于下降组（20.4%）或开放输卵管组（27.1%）（P<0.001）。培养24 h 和30 h，减数分裂恢复比例高于48 h（分别为69.2%和59.1%比35.8%，P<0.005）。卵母细胞减数分裂的恢复主要由减数分裂前的卵母细胞决定，而结扎输卵管后MI和MII 期占12.5%～31.9%。与24 h 和30 h 的培养（分别为18.7 和27.3%）相比，培养时间延长至48 h后，显著增加了卵母细胞的退化（59.3%），且输卵管上皮表现出培养后的核损伤和变性。研究表明，将犬卵母细胞置于游离输卵管中培养，减数分裂在培养的30 h内即恢复，对犬卵母细胞的成熟影响显著。此外，与较传统液滴培养或开放输卵管培养相比，在游离输卵管培养30 h 的卵母细胞存活率更高，但结扎的输卵管不能保证培养至48 h 的卵母细胞存活率。

3 展望

由于犬生殖生理的独特性，犬繁殖相关技术较其他动物发展缓慢，尤其国内对犬卵母细胞体外成熟的相关研究较少，犬卵母细胞体外成熟也成为限制犬IVF、ET 等繁殖技术发展的重要原因之一[5]。因此，应通过研究犬卵母细胞体外成熟的相关机理及技术来提高犬卵母细胞体外成熟率，为犬科动物辅助生殖的相关研究奠定基础。在其他哺乳动物卵母细胞体外成熟研究的基础上开拓新思路，采用先进技术来优化犬卵母细胞体外成熟体系[12]。据2005年已发布的犬全基因组序列数据，犬基因组与人的相似性达95.7 %[40]，且有研究表明，犬的多种遗传疾病与人相似。因此，深入研究犬科动物繁殖生物学的分子机制和人工调控方法，可以为创制人类疾病的犬科动物模型提供理论基础和技术支持，对进一步提高人类医疗保健水平以及拯救濒危犬科动物都具有重要意义[1]。