睾丸的细针穿刺法检测梅花鹿和马鹿杂交雄性后代是否可育的研究

陈敏，杨镒峰，曹俊国，陈秀敏，许保增，魏海军

（中国农业科学院特产研究所，长春 130112）

活体组织检查（Biopsy）简称“活检”，是医疗上诊断病理学的重要方法。常用于睾丸的活检方式主要有开放式活检、显微活检、细针抽吸活检和空芯针活检。开放式活检能够观察到睾丸白膜状态，通过获取的组织可以观察曲细精管直径、基质厚度等特征，但是创伤大，术后并发症的发病几率高[1]。而细针抽吸活检的优点是创伤小，少见手术并发症，短期内可以重复进行，其操作简单、快速、成本低，获得的材料可以用于量化精子的发生。在用穿刺法对骆驼睾丸的评估中，其结果与睾丸超声一致[2]。睾丸的细针穿刺在检测鹿的雄性不育，尤其是区别梗阻与非梗阻无精症方面是一种方便快捷而准确、安全的方法。Pintus 等[3-4]在马鹿上使用此项技术研究支持细胞和精子季节变化及唯支持细胞综合症。本试验采用细针穿刺细胞学检查和睾丸体积测量相结合的方法对梅花鹿和马鹿杂交F1 代是否可育进行初步调查。

1 材料与方法

1.1 实验动物

用于检测的花马杂交雄性后代来自A、B、C、D、E 5 个鹿场（表1）。其中，花马杂交雄性后代14 只，马花杂交雄性后代16 只，均为4 岁以上成年鹿。

表1 实验公鹿信息Table 1 Experimental male deer information

1.2 试剂、器械和仪器

10 mL 注射器/22G 针头（长春民建医疗器械有限公司）；多聚赖氨酸处理的防脱载玻片（南通海伦生物医学器材制造有限公司）；磷酸缓冲溶液（Gibco公司）；甲醇（分析纯，北京化工厂）；吉姆萨染料（上海歌凡生物公司）；鹿眠宝3 号（90.0%～110.0%尼可刹米）和鹿醒宝（95.0%～105.0%赛拉嗪）（青岛汉河动植物药业有限公司）；光学显微镜（Olympus Corporation 公司）；游标卡尺、恒温水浴锅（国华电器公司）

1.3 细针穿刺法

取样前由技术员对被试雄鹿注射适量鹿眠宝3 号进行麻醉，待完全麻醉自行倒卧之后用保定装置将公鹿保定。用手通过牵拉阴囊后方皮肤的方式将睾丸固定，防止睾丸位置移动。依次使用碘伏和75%的乙醇对待穿刺部位进行消毒，避开附睾和血管选择合适的穿刺位点，在睾丸不同部位进行穿刺采样（如采样时发现样品内混有血液则需要重新选择其他部位进行穿刺采样），每次采样的量以满足5 张涂片为宜。穿刺时轻柔进针，进入睾丸5～8mm，在不退出针头的情况下利用负压将组织吸出，缓慢拔出细针，用盖玻片将获取的细胞和组织均匀地涂抹在载玻片上，室温静置干燥，供细胞学检查。

1.4 睾丸细胞观察

1.4.1 染色 将0.1 g 吉姆萨染料与6.6 mL 甘油混合后在60 ℃中水浴2 h，每隔20 min 摇晃1 次，水浴结束后加入6.6 mL 甲醇；使用前再加入120 mL 磷酸缓冲溶液（pH 6.8）。

将待染色的载玻片放置在染色架上，浸入染色液中，室温放置15 min。取出载玻片，将其倾斜，使自来水从载玻片的反面成股流下，以达到轻柔冲洗的目的。

1.4.2 显微镜观察 在低倍镜下找到聚堆、互相不重叠的细胞，再在40 倍镜下根据其细胞形态及染色情况确定细胞的种类，每张载玻片选择5～8 个视野进行拍照保存。

1.5 睾丸体积测量

用游标卡尺分别测量鹿睾丸的长轴和短轴，并用公式V=4/3ab2（a=长半轴；b=短半轴）计算睾丸体积[5]。

2 结果

通过细针穿刺细胞学检查，共发现了3 头无法正常进行精子发生的雄鹿。正常杂交雄鹿细胞学检查结果见图1。

图1 正常杂交F1代雄鹿的细胞学检查Figure 1 Cytological examination of the normal hybrid F1 buck

086号雄性杂交鹿是由雌性马鹿与雄性梅花鹿交配得到的后代，来自B 鹿场。观察结果显示，未发现有成熟形态的精子。从图2 中可以看出，086 号鹿的精子发生终止于精子形成的第13 阶段，此时精子的细胞核缩短到之前的20%。根据鹿场技术员反映，2013年用该公鹿作为种鹿进行配种，母鹿均未受孕；2014年对086 号鹿进行人工采精，没有采集到正常精液。上述结果均证明该雄性杂交鹿是不育的，与细针穿刺法检测的结果是一致的。见图2。

图2 086号杂交鹿的细胞学检查结果Figure 2 Cytological examination of hybrid sterile buck 086

261号雄性鹿的母本是南疆马鹿，父本是梅花鹿，来自E 鹿场。睾丸细针穿刺取样后进行涂片检测试验，结果未发现有成熟形态的精子。从图3 中可以分辨出初级精母细胞（圆形、核质松散）和支持细胞（轮廓不清晰、染色较浅），没有出现过更接近精子的细胞，说明261 号精子的发生可能被阻止在较早的阶段。

图3 261号杂交鹿的细胞学检查结果Figure 3 Cytological examination of hybrid sterile buck 261

210号雄性鹿是马鹿（母本）与梅花鹿（父本）的杂交后代，来自E 鹿场。睾丸细针穿刺取样后进行涂片检测试验，结果未发现有成熟形态的精子，支持细胞占了多数，仅有部分精原细胞（细胞体积小、细胞核大），说明210 号鹿的精子发生在一开始就受到了阻碍（图4）。261号和210号鹿出自同一鹿场，两者都接受过6 次人工采精，均以失败告终，这与细胞学检测的结果同时说明261 号鹿和210 号鹿都是不育的。

图4 210号杂交鹿的细胞学检查结果Figure 4 Cytological examination of hybrid buck 210.

4头正常杂交雄性鹿（鹿号分别为2276 号、2272号、193 号和196 号）都来自B 鹿场，标本采集时间分别为7月（2276 号）、8月（2272 号）和10月（193 号和196 号）。精子细胞学发现，正常的雄鹿在发情期和乏情期睾丸内都是有正常形态的精子存在的（图5）。因此，可以采用细针穿刺法来提前检测雄鹿是否具有产生正常形态精子的能力。在生产实践中，可以提前采用此方法来预测雄性鹿的繁殖期能力，从而避免没有繁殖能力的雄鹿进入配种阶段，从而能避免由此带来的不必要的损失。

图5 花马杂交雄鹿的细胞学检查结果Figure 5 Cytological results of normal hybrid buck

通过对睾丸体积测定分析结果表明，不育雄鹿与可育雄鹿相比，两侧睾丸体积没有明显差别。086 号和261 号鹿的两侧睾丸均高于平均水平，但210 号鹿的两侧睾丸都大幅低于平均。见图6。

图6 不育雄性与正常雄鹿睾丸体积的对照Figure 6 Comparison of testicular volume between sterile males and normal males

通过按压睾丸表面发现，210 号鹿的睾丸硬度很低、弹性较小，而086 号鹿的睾丸硬度大于正常雄鹿、弹性较小。在现场的观察中还发现，这3 头不育雄鹿在繁殖期与可育杂交雄鹿发情、交配行为基本一致，具体表现为吼叫，吼叫时会伸长颈部并将头部仰起；泥浴，在泥土中排尿并在其中翻滚，使身体散发浓烈的气味；跟踪，有追逐雌鹿的行为；梳舔，雄鹿有主动靠近雌鹿，为其梳舔头部毛发的行为；爬跨，雄鹿使用前肢压在雌鹿背部后肢着地；有性行为反射。因此，雄鹿在繁殖期的发情交配行为和睾丸体积及状态能否作为检测雄性杂交鹿是否可育的一项指标，仍需要进一步的研究及验证。

3 讨论

对睾丸活检的研究和应用大多是针对人类患有非梗阻性无精子症的男性，采用辅助手段从局部生精灶获取精子以获得后代。常见的睾丸活检方法包括开放性睾丸活检、细针穿刺细胞学、活检枪、活检钳和显微切割睾丸活检等[6-9]。开放性睾丸活检是获取睾丸组织和评价精子发生最准确的方式，但是由于会诱发多种并发症而不被广泛采用[10-11]。细针穿刺细胞学是采用带针头的注射器对睾丸进行经皮穿刺，这种方法对睾丸的损伤很小，能同时清晰地观察到各种不同阶段的生殖细胞，同时不易引起并发症[12]。活检钳是采用输精管剥离钳的经皮穿刺，优点是创口小、出血少、取样率高。活检枪是利用高速机械切割原理来获得样品，其优点与活检钳类似，但造成的疼痛较轻[13]。显微切割是在解剖显微镜下操作的一种手术方法，近些年在人类临床上的应用比较普遍，这种方法能够避开白膜下血管，术中出血少，但由于设备的限制，并不方便采用此方法在养殖现场进行检查[14]。

在实际生产中，人们会优先选择鹿茸产量高的公鹿作为种鹿进行配种，因此有些产茸性状突出但没有生育能力的杂交公鹿会被误用做种鹿，这样就会给养殖者带来巨大经济损失，因此检测公鹿是否可育是非常有必要的。细针穿刺能够快速获取雄性睾丸器官中的间质细胞、生精小管等细胞、组织和体液，且检测过程简便易行，能够方便快速地判断公鹿是否能够作为种鹿参加配种，同时对被测公鹿的损伤轻微，是进行鹿生育能力检测的有效手段，在生产实际中可以采用此种方法对公鹿睾丸的检查，从而判断公鹿是否可以作为种鹿参加配种。Gosch[15]通过电刺激采精发现，黇鹿的精液体积是季节性变化的，其精子发生的活跃度在1年中是不同的，每年会有约3 个月的时间精子发生活动是停止的，在5～8月进行电刺激采精是不能获得精子的，然而在家畜中，从精子发生到成熟共需51～60d。本试验在繁殖期和非繁殖期都对杂交鹿进行了细针穿刺细胞学检查，在非繁殖期的检查结果中也能发现完整精子的存在，这就说明细针穿刺能够用于非繁殖期诊断杂交公鹿是否可育。尤其是在非繁殖季节电刺激采精不能获得精子的时候可以考虑采用细针穿刺的方法进行诊断，以获得更加准确的判断。这种检测方法的应用可以杜绝目前市场上把不育的杂交鹿作为种公鹿进行交易，避免广大养殖户遭受巨大的经济损失。

精子发生过程中各阶段的细胞有不同的形态，精原细胞一般为圆形或多角形，有典型的强分裂能力，细胞体积小但细胞核大，细胞核占细胞的比例很高，细胞核是圆形或卵圆形，染色质较大，占据了精原细胞的很大一部分体积；在经历了有丝分裂后，初级精母细胞的体积比精原细胞大，染色质松散，呈现颗粒状，之后初级精母细胞进入减数分裂阶段则会出现分裂相；初级精母细胞在经历了1 次减数分裂后变成次级精母细胞，其体积变小，呈椭圆形或者圆形，次级精母细胞一般存在的时间很短，因此，在细胞学检查时，视野中的次级精母细胞所占比例很小；精子细胞的体积随着形变的进行而不断变小，细胞变长、核变长；成熟精子的最明显特点是有长长的尾部[16]。睾丸体积能反应支持细胞的发育情况，而支持细胞能够为精细胞提供营养、调节生境周期，因此，睾丸的体积可能成为判断是否可育的标准[3]。对比这3 头鹿可以发现，它们的精子发生被阻断的阶段不同，推测引起这些雄鹿不育的原因可能有多个。