肾复康片对阳离子化牛血清白蛋白诱发大鼠膜性肾小球肾炎的作用研究

倪赛宏，袁家升，傅水莲，柳洪峰，何丽明，刘同彦，陈志国，邹丽园，王丹妮，洪铁※

（1.吉林大学药学院药理教研室，长春 130021；2.吉林敖东集团力源制药股份有限公司，吉林 延边 133700；3.吉林农业大学中药材学院，长春 130118；4.吉林大学中日联谊医院药剂科，长春 130033）

膜性肾小球肾炎（Membranous glomerulo-nephritis，MGN）是肾病综合征的成因之一，其病理特征是肾小球基底膜增厚和免疫复合物在上皮下沉积[1]。膜性肾小球肾炎的临床表现为全身水肿及无症状蛋白尿，约有45%膜性肾小球肾炎患者最终会导致终末期肾病[2]。临床治疗上主要以免疫抑制剂和糖皮质激素治疗为主，但由于其毒副作用较大，限制了临床的应用[3]。因此，寻求中医中药治疗膜性肾小球肾炎的有效药物具有重要意义。

肾复康片由土茯苓、槐花、白茅根、益母草、藿香药物组成，具有清热利尿、益肾化浊的功能，临床上用于治疗热淋涩痛、急性肾炎水肿、慢性肾炎急性发作。本研究通过尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白（CBSA），诱发大鼠膜性肾小球肾炎，观察肾复康片对大鼠膜性肾小球肾炎的治疗作用。

1 材料及仪器

1.1 动物

雄性Wistar 大鼠73 只，体重180～200 g，辽宁长生生物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（辽）2015-0001。放于实验室（环境温度22 ℃、相对湿度40%）适应环境。

1.2 药物及试剂

肾复康片（吉林敖东集团力源制药股份有限公司，批号：170105）；肾炎康复片（批号：HP17097，天津同仁堂集团股份有限公司）；牛血清白蛋白第5 组分（Sigma公司）；无水乙二胺（EDA）（天津市富宇精细化工有限公司，批号：20160712）；碳化二亚胺（EDC）（上海化成工业发展有限公司，批号：GHBNN-FJ）；弗氏不完全佐剂（北京鼎国生物技术有限责任公司，批号：230R001170）；BCA试剂盒（大连美仑生物技术有限公司, 批号：MA0082-Sep-21B）；肌酐试剂盒（批号：20171020）、尿素氮试剂盒（批号：20171025）、白蛋白试剂盒（批号：20171022）（南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.3 仪器

代谢笼（江苏赛昂斯生物科技有限公司）；T-100 天平〔美国双杰兄弟（集团）有限公司〕；3-18K离心机（德国Sigma 公司）；微孔板分光光度计（美国伯腾仪器有限公司）。

2 方法

2.1 阳离子化牛血清白蛋白的制备

采用改良Border 法[4]制备。取67 mL EDA 加入500 mL 双蒸水中并混匀，缓慢加入6 mol/L 的盐酸350mL，调节pH 至4.75，保持温度在25 ℃；取牛血清白蛋白（BSA）5 g溶于25 mL双蒸水中，缓慢加入EDA溶液中，搅拌后，加入1.8 g EDC，持续搅拌2 h 并维持25 ℃，保持pH4.75，加入4 mol/L（pH4.75）醋酸盐缓冲液30 mL，终止反应，即得阳离子化牛血清白蛋白（CBSA）溶液。4 ℃双蒸水中透析72 h（3～5 h 更换1 次双蒸水），经冷冻干燥机充分冷冻干燥，即得到C-BSA冻干粉剂，密封保存于 80℃冰箱内。注射前用0.01 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）配制成溶液。

2.2 C-BSA诱发大鼠膜性肾小球肾炎模型的建立

73 只Wistar 雄性大鼠适应性喂养3 d 后，随机取8 只作为正常对照组，其余65 只统一进行造模。预免疫：C-BSA100 mg，溶于3.75 mL PBS中，加入26.25 mL弗氏不完全佐剂充分混合乳化，除正常组外，其余各组于每只大鼠的双侧腋下、背部及腹股沟多个位置皮下注射，每只大鼠注射0.3 mL，每点注射不超过0.05 mL，隔日1 次，1 周3 次。预免疫1 周后，开始正式免疫，大鼠隔日1 次尾静脉注射C-BSA 3.5 mg/只（注射前用1 mL PBS 配成溶液），每周注射3 次，共计4 周。造模28d后测定大鼠24h尿蛋白量为139.74mg（P＜0.01），证实阳离子化牛血清白蛋白诱导大鼠肾炎模型成功。

2.3 分组及给药

免疫结束后按尿蛋白高低将大鼠分为5 组并编号，即模型对照组、阳性药组（0.648 g/kg）、肾复康片高剂量组（1.0 g/kg）、肾复康片中剂量组（0.50 g/kg）、肾复康片低剂量组（0.25 g/kg）。每天灌胃给药1 次，正常对照组及模型对照组给予同体积蒸馏水，连续给药6周。

2.4 测定指标

2.4.1 24 h 尿蛋白量 分别于造模结束第0 周、第2周、第4 周，第6 周将大鼠放置于代谢笼中，收集大鼠的24 h 尿液，并记录尿量，测定24 h 尿蛋白量。

2.4.2 生化指标 实验结束后腹主动脉取血，测定血清中血肌酐（Scr），尿素氮（BUN），总蛋白（TP），白蛋白（Alb）含量，具体方法按试剂盒标示方法进行。

2.4.3 苏木素-伊红（HE）染色观察肾组织病理变化

每只大鼠摘取右侧肾脏，立即投入10%的多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，5m连续切片，经HE染色，光学显微镜下观察大鼠肾组织病理变化情况。

3 统计

4 结果

4.1 肾复康片对24h尿蛋白量的影响

给药后第2 周、第4 周、第6 周，模型组尿蛋白量与正常对照组相比有明显差异（P ＜0.01）；给药后第2 周，肾复康片高剂量组与模型对照组相比有明显差异（P＜0.05），其他各给药组均有明显的降低趋势，但无统计学意义；给药后第4 周，肾复康片高剂量组与模型对照组相比有明显差异（P＜0.05），阳性药组、肾复康片中剂量组均有降低趋势，但无统计学意义；给药后第6 周，肾复康片高剂量组与模型对照组相比有明显差异（P＜0.01），肾复康片中剂量组有降低趋势，但无统计学意义。见表1。

表1 肾复康片对阳离子化牛血清白蛋白诱发大鼠膜性肾小球肾炎24 h 尿蛋白量影响Table 1 Effect of Shenfukang tablet on 24h urine protein levels on membrane glomerulo-nephritis-induced by cationic bovine serum albumin in rats

4.2 生化指标检测

血清肌酐含量模型对照组与正常对照组相比有明显差异（P ＜0.01），阳性药组、肾复康片高剂量组、中剂量组与模型对照组相比有明显差异（P ＜0.01），肾复康片低剂量组与模型对照组相比有明显差异（P ＜0.05）；尿素氮含量模型对照组与正常对照组相比有明显差异（P ＜0.01），肾复康片高剂量组与模型对照组相比有明显差异（P ＜0.01）；血清中总蛋白含量模型对照组与正常对照组相比有明显差异（P ＜0.01），肾复康片高剂量组与模型组相比有明显差异（P＜0.05），其他给药组均有增加趋势，但无统计学意义；白蛋白含量模型对照组与正常对照组相比有明显差异（P ＜0.01），肾复康片高剂量组与模型对照组相比有明显差异（P＜0.01），阳性药组、肾复康片中剂量组与模型对照组相比有明显差异（P ＜0.05）。见表2、见表3。

表2 肾复康片对膜性肾小球肾炎大鼠血清中肌酐、尿素氮影响Table 2 Effect of Shenfukang tablet on Scr and BUN levels in serum on membrane glomerulo-nephritis-induced by cationic bovine serum albumin in rats

表3 肾复康片对膜性肾小球肾炎大鼠血清中总蛋白、白蛋白影响Table 3 Effect of Shenfukang tablet on TP and Alb levels in serum on membrane glomerulo-nephritis-induced by cationic bovine serum albumin in rats

4.3 病理检查结果

病理结果显示，正常对照组大鼠肾小球形态基本正常；模型对照组大鼠肾小球明显肿胀，固有细胞明显增多，基底膜增厚；与模型对照组相比，肾复康片高剂量组、中剂量组大鼠的肾小球肿胀减轻，肾小球固有细胞增多、基底膜增厚程度明显减轻。见图1。

图1 肾复康片对膜性肾小球肾炎大鼠病理变化的影响（HE，400×）Figure 1 Effect of Shenfukang tablet on pathological changes on membrane glomerulo-nephritis-induced by cationic bovine serum albumin in rats

5 讨论

膜性肾小球肾炎[5]是免疫球蛋白和补体成分沉积在肾小球毛细血管壁上皮层引起的一种抗体介导的自身免疫性疾病[6]。抗原抗体免疫复合物引起的免疫损伤是膜性肾小球肾炎的主要发病机理[7]。C-BSA 诱发膜性肾小球肾炎大鼠模型的原理是C-BSA 带有正电荷，在富含负电荷的肾小球基膜上结合而沉积在基膜上，吸引血液循环的相应抗体，导致肾脏局部免疫复合物的形成[8]。与其他模型如毒性物质引起的肾炎模型比较，C-BSA诱发的肾炎模型的发病机理及病理过程与临床常见的肾小球肾炎更为相似，对于研究肾小球肾炎病变、生理生化变化、评价药物作用疗效等均具有一定意义[9]。

大量蛋白尿和低蛋白血症是肾脏病变的标志，蛋白尿排出增加使肾小球损伤逐渐加重，蛋白尿引起的肾小球病变可导致肾小球滤过屏障丧失，肾小球对血浆中的蛋白质通透性增加，使血浆蛋白从肾小球毛细血管壁滤过，血浆蛋白自尿液中丢失，从而导致肾小球硬化，病情不断加重[10]，降低蛋白尿、延缓肾脏疾病恶化是药物治疗的主要指标之一[11]。本实验结果显示，给药后肾复康片高剂量组降低大鼠24 h 尿蛋白的作用最明显，而模型对照组尿蛋白依然严重；给药后肾复康片高、中剂量组血清中TP、Alb 含量增加，而模型对照组TP、Alb 含量明显降低，表明肾复康片能减少膜性肾小球肾炎大鼠尿蛋白，增加TP、Alb 含量，对大鼠膜性肾小球肾炎有改善作用。

血清中Scr 和BUN 分别为含氮有机物和蛋白质代谢的终末产物，在肾功能正常的情况下，这些小分子物质从肾小球滤出，当肾小球滤过功能损伤时，血中Scr和BUN含量增高[12]。所以在临床上，Scr 和BUN含量可以反映肾小球的滤过功能，常用作判断肾功能的重要指标。给药后，肾复康片高、中、低剂量组可降低血中Scr的含量；肾复康片高、中剂量组可降低BUN 含量。研究结果表明，肾复康片对阳离子化牛血清白蛋白诱发大鼠膜性肾小球肾炎有良好的治疗作用。