西洋参果多糖的纯化及DPPH自由基清除活性研究

李珊珊，祁玉丽,2，曲迪，张磊，孙印石,2※

（1.中国农业科学院特产研究所，长春 130112；2.吉林农业大学中药材学院，长春 130118）

西洋参（Panax quinquefolius）属五加科人参属植物，原产于美国和加拿大，现我国也有栽培。西洋参味甘、微苦，性寒，能补气、养阴、清火。关于西洋参的研究较多，而其果实的研究较少。西洋参果中含有皂苷、糖类等成分[1]。多糖在西洋参果中含量丰富，但目前为止相关报道非常少。西洋参果多糖能够显著降低ob/ob小鼠的空腹血糖水平，增加小鼠对葡萄糖的耐受性，具有明显的降血糖活性[2]。本试验对西洋参果水溶性总多糖进行系统地分级和纯化，并对其单糖组成、总糖含量、糖醛酸含量、分子量分布及1，1-二苯基-2-二硝基苯肼（DPPH）自由基清除活性进行分析和检测，为西洋参果的进一步加工利用提供实验依据和基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西洋参果采收于吉林省抚松县；单糖标准品（Sigma-Aldrich 公司）；层析柱和凝胶（GE 公司）；DPPH（Cat#CD4891-500MG，Coolaber公司）；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TGL-16A 高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；FD-1A-50 低温冷冻干燥机（北京博医康技术有限公司）；QD8J（BL）单煎机（青岛达尔电子机械销售有限公司）；HHS型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

高效液相色谱仪及色谱柱、SPD-M20A 紫外检测器、LC-16溶剂输送泵、CTO-16柱温箱（日本岛津仪器有限公司）；ODS Hypersil 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5m）（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 西洋参果总多糖的提取 采收新鲜西洋参果，手搓去籽，果肉加入蒸馏水8 L/ kg，单煎机100 ℃提取4 h，纱布（100 目）过滤，留取滤液，沉淀重复提取2次。合并3 次提取所得滤液，单煎机微沸状态浓缩至1.5 L，离心（4 500 r/min，10 min），弃去沉淀，上清于60 ℃水浴浓缩至终体积为1 L，冷却至室温。加入4 L 无水乙醇，静置5 h，离心（4 500 r/min，10 min），收集沉淀。向沉淀中加入800 mL 蒸馏水，充分溶解，重复上述醇沉步骤。沉淀用蒸馏水复溶后冷冻干燥，得西洋参果总多糖（WQBP）。

1.3.2 西洋参果多糖的分离纯化 取5 g WQBP溶于80 mL 蒸馏水中，离心（4 500 r/min，10 min），上样于DEAE-Sepharose Fastflow 层析柱，依次用2 L 蒸馏水和0.5 mol/L NaCl 溶液洗脱，流速10 mL/min，每烧杯收集50 mL 洗脱液。分别收集不同的洗脱峰，水洗脱级分浓缩后冷冻干燥，得到中性糖级分WQBP-N；盐洗脱级分透析除盐后冷冻干燥，得到酸性糖级分WQBP-A。

1.3.3 理化性质测定 采用苯酚-硫酸法测定总糖含量[3]；间羟基联苯法测定糖醛酸的含量[4]。单糖组成分析[5-6]：称取2 mg 多糖样品，依次用1 mol/L 盐酸-甲醇溶液和2 mol/L 三氟乙酸溶液水解。除去有机试剂后，PMP 衍生化，HPLC 检测。HPLC 系统：Hypertsil ODS色谱柱，柱温35℃，流动相82.0% PBS（0.1 mol/L，pH 7.0）和18.0%乙腈（v/v），等梯度洗脱，流速1.0mL/min，进样量20L，检测波长245 nm。

1.3.4 多糖级分的分子筛层析分析 取5 mg 多糖样品溶于1mL 蒸馏水中，离心（10000r/min，5min），上清液上样于Sepharose CL-6B 凝胶层析分析柱[7]，0.15 mol/L NaCl溶液洗脱，流速0.15 mL/min，收集器20 mL/管自动收集洗脱液。测定洗脱液的总糖和糖醛酸含量分布，绘制洗脱曲线。

1.3.5 多糖级分的DPPH 清除率检测 将样品配制成0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL 浓度梯度的水溶液。取0.5 mL 样品溶液，加入0.5 mL 5%DPPH 乙醇溶液，混匀后避光反应1 h，517 nm 测吸光值[8]。DPPH 清除率=〔1 （A 样品 A空白）/A 对照〕×100%，A 样品：0.5 mL 样品溶液+0.5 mL DPPH；A 空白：0.5 mL 样品溶液+0.5 mL 无水乙醇；A 对照：0.5 mL DPPH+0.5 mL 蒸馏水。

2 结果与分析

2.1 西洋参果多糖的分级纯化及单糖组成分析

西洋参果多糖得率为0.7%。通过HPLC 分析单糖组成（表1），WQBP主要由鼠李糖（Rhamnose，Rha，5.9%）、半乳糖醛酸（Galacturonic acid，GalA，8.6%）、半乳糖（Galactose，Gal，51.8%）、阿拉伯糖（Arabinose，Ara，14.0%）、葡萄糖（Glucose，Glc，16.4%）和少量葡萄糖醛酸（Glucuronic acid，GlcA）、甘露糖（Mannose，Man）组成。WQBP 在Sepharose CL-6B 分析柱上呈现不均一的峰（图1），分子量分布较广，不适合用该层析柱进行进一步的分级纯化。

表1 西洋参果多糖各级分的得率、总糖含量、糖醛酸含量及单糖组成Table 1 Yield,total carbohydrate contents,uronic acid contents and monosaccharide composition of P.quinquefolius berry polysaccharide fractions

图1 WQBP 在Sepharose CL-6B 分析柱上的洗脱曲线Fig.1 Elution profiles of WQBP on Sepharose CL-6B

2.1.1 离子交换层析纯化 将WQBP 上样于DEAESepharose Fastflow 制备柱，依次用蒸馏水、0.5 mol/L NaCl 洗脱，得到1 个中性糖级分WQBP-N 和1 个酸性糖级分WQBP-A（图2），得率及单糖组成见表1。

图2 WQBP 经DEAE-Sepharose Fastflow 层析柱分级纯化洗脱曲线Fig.2 Elution profiles of WQBP on DEAE-Sepharose Fastflow column

2.1.2 西洋参果多糖级分的分子筛层析和单糖组成分析 WQBP-N是西洋参果多糖的中性糖级分，在Sepharose CL-6B分析柱上呈现2 个明显的洗脱峰（图3）。WQBP-N 主要由Gal、Ara、Glc 和Man 组成（表1），比例为63.9∶19.3∶15.2∶1.5，其中，Gal含量最高，可能含有半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖等结构单元。

图3 WQBP-N 在Sepharose CL-6B 柱层析上的洗脱曲线Fig.3 Elution profiles of WQBP-N on Sepharose CL-6B

WQBP-A 在Sepharose CL-6B 层析柱上呈现2 个明显的洗脱峰（图4）。WQBP-A 主要由Rha（13.1%）、GalA（13.2%）、Gal（46.4%）、Ara（19.0%）组成，含有少量的Man、Glc 和GlcA（表1）。Rha 与GalA 的比例为0.99∶1，符合文献[9]中对I 型聚鼠李半乳糖醛酸果胶（Type I rhamnogalacturonan，RG-I）的定义。根据Rha与GalA 的含量与比例可以推测，WQBP-A 中含有RG-I结构域，Gal 和Ara 含量较高，可能含有阿拉伯半乳聚糖结构单元。

图4 WQBP-A 在Sepharose CL-6B 柱层析上的洗脱曲线Fig.4 Elution profiles of WQBP-A on Sepharose CL-6B

2.2 西洋参果多糖各级分对DPPH自由基的清除活性

西洋参果总多糖WQBP 具有显著的DPPH 自由基清除活性。在0.1～1 mg/mL 范围内清除率随浓度的升高而逐渐加强，当WQBP 浓度为1.0 mg/mL 时，清除率可达82.1%。WQBP-N 对DPPH 自由基的清除活性最弱。WQBP-A 活性弱于WQBP，略高于WQBP-N，并且也有一定的浓度依赖性。见图5。

图5 西洋参果多糖各级分的DPPH 清除率Fig.5 Scavenge ability of DPPH radical of P.quinquefolius berry polysaccharide fractions

3 讨论

多糖是自然界最为丰富的物质之一，具有多种药理活性[10-12]。本研究对西洋参果多糖进行了提取、分级和纯化，分析各级分的单糖组成、总糖含量、糖醛酸含量等发现，西洋参果多糖中含有丰富的GalA、Gal、Ara 和Rha。WQBP-N 含有半乳聚糖结构，但具体的糖苷键连接方式和比例还不清楚。WQBP-A 为富含Rha 和GalA 的酸性果胶组分，属于杂多糖，分子量和电荷不均一。WQBP 具有显著的DPPH 自由基清除活性和潜在的抗氧化能力，且活性优于WQBP-N 和WQBP-A。对这些多糖级分进行进一步的纯化，获得均一多糖，进而分析其精细结构，如糖苷键的连接方式、比例、是否含有特殊基团等，对研究多糖的结构与活性的关系具有重要意义，也是下一步研究的重点。