乌苏里瓦韦对小鼠镇咳、祛痰作用研究

谭静，林红强，吴福林，郑炳真，董庆海，李平亚，刘金平，王涵

（吉林大学药学院天然药物研究中心，长春 130021）

乌苏里瓦韦为蕨类水龙骨科（Polypodiaceae）瓦韦属（Lepisorus）植物乌苏里瓦韦〔Lepisorus ussuriensis（Regel et Maack）Ching〕的干燥全草，别名骟鸡尾、石茶、树茶、铁包针、剑刀草、大石韦等，主要分布于吉林省、黑龙江省、安徽省、河南省、山东省、河北省、辽宁省等海拔750～1 700 m地区，附生林下或山坡阴处，野生资源较为丰富[1]。乌苏里瓦韦富含黄酮类、皂苷类、有机酸类及甾体类等成分[2]，绿原酸、叶黄素、蜕皮甾酮和黄酮类物质是其主要药效物质基础[3]。乌苏里瓦韦味苦、性平、无毒，具有清热解毒、利尿、止血、消肿等功效[4]。现代药理学研究表明，其有抑菌、抗炎、抗癌、抗氧化等活性[5-6]。民间广泛用于治疗小便不利、小便淋痛、水肿、尿血、咽喉肿痛、湿热痢疾、疮疡肿毒、刀伤出血等多种病症，也将其制成茶叶用于治疗各种炎症疼痛[7-9]。

为进一步开发利用该药用植物，本试验对其进行了活性筛选。根据文献报道，乌苏里瓦韦抗小鼠耳廓肿胀活性的药效物质可能是黄酮类以及酚酸类物质[10]，故本课题组以95%乙醇进行回流提取，获得了含量较高的总黄酮和总酚酸类物质，并首次通过氨水引咳和酚红排泌等经典模型研究了乌苏里瓦韦95%乙醇提取物的镇咳和祛痰作用，继而采用气管注射脂多糖（LPS）造成急性呼吸道炎症模型以探讨提取物是否通过抗炎机制而发挥药理作用。

1 材料、仪器

1.1 材料

乌苏里瓦韦采于吉林省磐石市烟筒山镇和平屯东山，经吉林大学药学院李平亚教授鉴定为蕨类水龙骨科植物乌苏里瓦韦（L.ussuriensis）的全草，存放于吉林大学再生医学研究所新药研发标本室。乌苏里瓦韦95%乙醇回流提取物由本实验室自制，紫外-可见分光光度计测定物质含量，其中，总黄酮15.8%、总酚酸8.7%。试验前，用纯净水配制成0.16g/mL、0.08g/mL、0.04g/mL的溶液。

SPF 级ICR 小鼠130 只，雌、雄各半，（20±2）g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，合格证号：SCXK（吉）-2016-003。室温22 ℃～24 ℃、相对湿度55%～65%环境中饲养，自由采食饮水。

枸橼酸喷托维林片（国药准字号：H12020234，批号：1611014，天津力生制药股份有限公司，灌胃前用纯净水制成2.5 mg/mL 的溶液）；脂多糖（LPS，批号：O0808A，大连美仑生物技术有限公司）；肿瘤坏死因子-（TNF-）ELISA 检测试剂盒（批号：201802，上海诺渊生物科技有限公司）；小鼠白细胞介素1（IL-1 ）和小鼠白细胞介素6（IL-6）ELISA 检测试剂盒（批号：20171220-4812，武汉华德试剂有限公司）。

碳酸氢钠（NaHCO3，批号：20180110，北京化工厂）；酚红（批号：C10115997，上海麦克林生化科技有限公司）；氨水（批号：171008001，西陇科学股份有限公司）；10%水合氯醛（批号：20150312，沈阳市试剂三厂）。所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器

FA1104N 电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；TGL-16-aR 高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；722 紫外-可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）；BIO-RAD酶标仪（上海伯乐生命医学产品有限公司）。

2 试验方法

2.1 乌苏里瓦韦95%乙醇提取物对氨水引咳模型小鼠的影响

小鼠适应性饲养7 d 后，放入钟罩内，再将重量、形状基本一致的棉球放入钟罩内，迅速向棉球中注入1.0 mL 25%的浓氨水，密闭20 s 后取出小鼠，以小鼠抬头、张嘴并伴有腹肌收缩等咳嗽动作者即为咳嗽1次[11]。从取出小鼠后开始计时，记录小鼠的咳嗽潜伏期和3 min 内的咳嗽次数，剔除3 min 内不咳嗽的老鼠[12-13]。

将挑选好的50 只小鼠按性别、体重随机分为5 组，即空白对照组、阳性对照组（枸橼酸喷托维林25 mg/kg）、乌苏里瓦韦高剂量组（1.6 g/kg）、乌苏里瓦韦中剂量组（0.8 g/kg）、乌苏里瓦韦低剂量组（0.4 g/kg），每组10 只。各组小鼠灌胃给药（10 mL/kg），空白对照组灌胃给予纯净水，连续给药7 d，每天灌胃给药1 次。末次给药1 h 后，按上述方法测定小鼠的咳嗽潜伏期和3 min 内的咳嗽次数[14]。

2.2 乌苏里瓦韦95%乙醇提取物对小鼠气管段酚红排泌的影响

准确称取10 mg 酚红，加5%NaHCO3 溶液100 mL溶解，依次稀释为0.1g/mL、0.3g/mL、0.5g/mL、0.7g/mL、1.0g/mL、3.0g/mL、5.0g/mL、7.0g/mL、10.0g/mL 的溶液，546 nm 处测定吸光度[15]，以酚红浓度为横坐标（X）、吸光度（Y）为纵坐标做标准曲线，得回归方程：Y=0.126X+0.037 7（r2=0.999 3）。

ICR 小鼠50 只，雌、雄各半，适应性饲养7 d，分组、给药同“2.1”项下方法。末次给药1h 后，每只小鼠腹腔注射（20 mL/kg）2.5%酚红生理盐水溶液，注射30 min后脱颈椎处死小鼠，钝性剖离气管周围组织及食道，充分暴露出气管，用止血钳夹住自甲状软骨至气管分叉处的气管两端，防止气管内的液体流出。将气管剪下后，用生理盐水清洗气管表面残留的血液，加0.5%NaHCO3溶液2mL，超声10min，3000r/min离心5 min，取上清液于546 nm 处测定吸光度值[11]。

2.3 乌苏里瓦韦95%乙醇提取物对急性炎症小鼠IL-6、IL-1及TNF-的影响[16]

ICR小鼠30 只，雌、雄各半，适应性饲养7 d，随机分为正常对照组、模型组、乌苏里瓦韦高剂量组（1.6g/kg）3 组。各组小鼠均连续灌胃给药7 d，末次给药1 h 后，各组小鼠腹腔注射10%水合氯醛（5mL/kg）麻醉。正常对照组小鼠麻醉后不作处理，给药组和模型组小鼠仰卧位固定，用镊子捏起颈部皮肤，于颈正中线剪一小口，暴露皮下组织，用无菌棉棒钝性分离颈部软组织和肌肉，露出气管，向气管内缓缓注入LPS 溶液100L（10 mg/Kg），随后立即竖立小鼠，并旋转体位以便于LPS 溶液在肺内进行全面的分布，创口缝合，碘伏消毒；2 h 后，小鼠眼眶取血，3 000 r/min（4 ℃）离心10 min，取上清液，按试剂盒说明书方法测定血清中IL-6、IL-1 及TNF-的含量。

2.4 数据处理

3 试验结果

3.1 乌苏里瓦韦95%乙醇提取物对氨水引咳模型小鼠的影响

与空白对照组比较，乌苏里瓦韦提取物高、中剂量组的咳嗽潜伏期明显延长，咳嗽次数明显减少（P ＜0.01，P＜0.05），与阳性药枸橼酸喷托维林具有类似的作用；乌苏里瓦韦提取物低剂量组未见明显作用。见表1。

表1 乌苏里瓦韦对小鼠氨水引咳潜伏期和咳嗽次数的影响Table 1 Effects of L.ussuriensis on the mice ammonia induced cough latency and cough times （n=10，±s）

表1 乌苏里瓦韦对小鼠氨水引咳潜伏期和咳嗽次数的影响Table 1 Effects of L.ussuriensis on the mice ammonia induced cough latency and cough times （n=10，±s）

注：与空白对照组比较，*.P ＜0.05；**.P ＜0.01。下表同。Note:Compared with the blank control group,*.P ＜0.05;**.P ＜0.01.The table below is the same.

组别Group name剂量Dose引咳潜伏期（s）Coughing latency咳嗽次数Cough times空白对照组 Blank control group - 2.62±0.89 29.80±18.98枸橼酸喷托维林组 Pentoxyverine group 25mg/kg 4.29±1.46** 12.40±2.50**乌苏里瓦韦高剂量组 L.ussuriensis high dose group 1.6g/kg 6.05±3.26** 11.20±6.01**乌苏里瓦韦中剂量组 L.ussuriensis medium dose group 0.8g/kg 4.12±2.04* 16.60±5.58*乌苏里瓦韦低剂量组 L.ussuriensis low dose group 0.4g/kg 2.16±1.08 35.80±16.86

3.2 乌苏里瓦韦95%乙醇提取物对小鼠气管段酚红排泌的影响

随着小鼠气管内分泌的粘液增加，气管内的酚红排泌量也增多[15]。与空白对照组比较，乌苏里瓦韦高、中剂量组可使小鼠气管酚红排泌量明显增加，具有统计学意义（P＜0.05）；低剂量组无统计学意义。见表2。

表2 乌苏里瓦韦对小鼠气管段酚红排泌的影响Table 2 Effects of L.ussuriensis on phenol red secretion in mice tracheal segments （n=10，±s）

表2 乌苏里瓦韦对小鼠气管段酚红排泌的影响Table 2 Effects of L.ussuriensis on phenol red secretion in mice tracheal segments （n=10，±s）

组别 Group name 剂量Dose酚红排泌量（ g/mL）Phenol red excretion空白对照组 Blank control group - 0.37±0.13枸橼酸喷托维林组 Pentoxyverine group 25mg/kg 0.55±0.17*乌苏里瓦韦高剂量组 L.ussuriensis high dose group 1.6g/kg 0.56±0.25*乌苏里瓦韦中剂量组 L.ussuriensis medium dose group 0.8g/kg 0.49±0.11*乌苏里瓦韦低剂量组 L.ussuriensis low dose group 0.4g/kg 0.45±0.17

3.3 乌苏里瓦韦95%乙醇提取物对小鼠IL-6、IL-1及TNF-的影响

炎症反应是当机体受到外界损伤或致炎因素刺激时，单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞被激活，在受损部位大量聚集，产生一系列的炎性细胞因子，包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8 和TNF-等[17-18]，其中，最为主要的促炎因子有IL-6、IL-1和TNF-等。

将LPS 注入气管内后，与正常对照组比较，模型组血清中IL-6、IL-1及TNF-的含量明显增加，具有统计学意义（P ＜0.01），表明小鼠急性炎症模型造模成功。

表3 乌苏里瓦韦对小鼠IL-6、IL-1 及TNF- 的影响Table 3 Effects of L.ussuriensis on IL-6,IL-1 and TNF- in mice （n=10，±s）

表3 乌苏里瓦韦对小鼠IL-6、IL-1 及TNF- 的影响Table 3 Effects of L.ussuriensis on IL-6,IL-1 and TNF- in mice （n=10，±s）

组别 Group name 剂量 Dose IL-6 IL-1 TNF-空白对照组 Blank control group - 8.95±1.36 11.16±1.82 58.54±3.14模型对照组 Model control group - 11.49±1.15** 12.80±2.41** 105.86±28.04**乌苏里瓦韦高剂量组 L.ussuriensis high dose group 1.6g/kg 10.10±0.69** 11.71±1.74* 69.20±4.07*

4 讨论

咳嗽作为呼吸道常见症状，具有清除呼吸道异物和分泌物的保护性作用。常用的镇咳药理活性研究模型包括氨水引咳法、SO2 引咳法、辣椒素引咳法、豚鼠枸橼酸引咳法[19，20]。其中，以氨水引咳法最为经典，故本试验采取该法测定乌苏里瓦韦的镇咳作用。

痰液是呼吸道受炎症因子侵入时，纤毛运动减慢，粘膜上皮受损，黏蛋白分泌异常增加，积累粘液而引起的痰状物质。祛痰药可使痰液变稀而易于咳出，主要是通过改善咳嗽清除率和黏液纤毛系统清除率来祛痰[21]。常用的祛痰药理活性研究模型包括气管酚红排泌法、毛细玻管法[22]。其中，气管酚红排泌法是利用酚红能够部分从气管排泌的特点，准确性好、可操作性强，主要针对小鼠；毛细玻管法主要针对大鼠，故本试验采取该法考察乌苏里瓦韦的祛痰活性。

IL-6 为活化的T 细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子，是能使B细胞前体成为产生抗体的细胞，又名B细胞刺激因子，在被TNF-和IL-1诱导后，通过激活炎性介质来调节急性炎症反应及免疫功能等[23]。IL-1是免疫细胞在免疫应答时产生的细胞因子，能够刺激T 细胞产生IL-2，在免疫应答和组织修复中起重要作用，有IL-1和IL-12 种形式，其中，IL-1又名前炎性反应细胞因子、淋巴细胞活化因子，能通过多种生物学功能参与免疫应激和信号传导，在受到致炎因素刺激时较短时间内可促使炎症的级联反应的发生，几小时内便可达到峰值[24]。TNF-是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一，在炎性细胞的增殖、分化中起到重要的中介作用。有研究证实，血清中TNF-的含量与急性肺损伤的严重程度呈正相关[25]。本试验中选用IL-6、IL-1和TNF-作为指标成分以判断乌苏里瓦韦是否具有抗炎作用，进而判断其是否通过抗炎而发挥镇咳和祛痰的药理作用。抗炎药理活性研究中，LPS 的常用给药方式有腹腔注射法、气管内滴入法、气管内注射法和气管内雾化法等，其中，气管内雾化法缺少相关实验器材，气管内注射法相比腹腔注射靶向性更强，相比于滴入操作更简便[16]，故本试验采取该法考察乌苏里瓦韦的祛痰活性。

药用植物乌苏里瓦韦具有清热解毒、利尿消肿、止咳止血等功效，具有较好的抗小鼠耳廓肿胀的作用，但未见其镇咳和祛痰作用的研究。为开发防治呼吸系统疾病的中草药提供理论数据，本试验以乌苏里瓦韦95%乙醇提取物（总黄酮15.8%、总酚酸8.7%）为样品，研究了其对小鼠的镇咳和祛痰作用，并初步探讨了其作用机制。实验结果表明，乌苏里瓦韦提取物高、中剂量组能够延长氨水诱导的小鼠咳嗽潜伏期，同时显著减少单位时间内咳嗽次数，并能够显著促进小鼠气管酚红的排泌量，表明其具有较好的镇咳和祛痰作用。在机制的初步探讨中发现，镇咳和祛痰作用最为显著的乌苏里瓦韦高剂量组能够明显降低LPS诱导的ICR小鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-的含量，提示镇咳和祛痰作用可能与抑制血清中的炎症因子和TNF-有关。