紫外-可见分光光度法测定灵芝片中多糖、三萜及甾醇含量

姜 玮 ，周桂生 ，陈骁鹏 ，叶 慧 ，乔 正 ，白钢钢 ，赵金龙 △

（1.江苏省泰州市食品药品检验所，江苏 泰州 225300； 2.南京中医药大学，江苏 南京 210046；3.中国药科大学，江苏 南京 210046）

灵芝为多孔菌科真菌赤芝 Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst. 或紫芝 Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体，是传统的大型药用真菌，多糖、三萜及甾醇类化合物是其主要药理活性成分[1-2]。多糖类化合物具有提高机体免疫力、耐缺氧能力等作用，三萜及甾醇类化合物具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒(如艾滋病毒)等作用，因此，多糖类、三萜及甾醇类化合物的含量是判断灵芝品质的重要指标[3-12]。为方便药材调剂、制剂与有效成分的溶出，药材市场上的灵芝以灵芝片（由灵芝切片而来）较多见，但2015年版《中国药典(一部)》灵芝项下并未收录灵芝片的质量标准[13]。因此，制订以多糖类、三萜及甾醇类化合物含量测定为主的灵芝片质量标准，对于规范中药材市场的灵芝片及提高灵芝片质量具有重要意义。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV-2700型紫外分光光度计（日本岛津公司）；Mettler XS105DU型电子天平（瑞士梅特勒公司）；Milli-Q Advantage A10型超纯水系统，SK8200GP型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；DK-S24型电热恒温水浴锅（上海三发科学仪器有限公司）；LR-16型高速冷冻离心机（北京雷勃尔医疗器械有限公司）。

1.2 试药

试剂：甲醇、硫酸、蒽酮、冰醋酸、香草醛、乙醇、高氯酸、乙酸乙酯均为分析纯，试验用水皆为超纯水；D-无水葡萄糖对照品（批号为 110833-201205，含量为99.5%），齐墩果酸对照品（批号为110709-200304，含量为100%），均由中国食品药品检定研究院提供。

显色剂：称取蒽酮0.2 g，精密称定，加硫酸200 mL使溶解，摇匀（临用新配），即得硫酸蒽酮溶液；称取香草醛5 g，精密称定，加冰醋酸溶解并定容至100 mL（临用新配），即得香草醛冰醋酸溶液。5批灵芝片，均通过泰州市食品药品检验所中药室叶慧副主任中药师鉴定，详见表1。

表1 灵芝片来源及批号

2 方法与结果

2.1 多糖含量测定

2.1.1 溶液制备

对照品溶液：称取 D-无水葡萄糖对照品13.07 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为0.130 0 mg/mL的溶液，即得。

供试品溶液：取本品粉末约2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水60 mL，静置1 h，加热回流4 h，趁热滤过，用少量热水洗涤滤器和滤渣，将滤渣及滤纸置烧瓶中，加水60 mL，加热回流3 h，趁热滤过，合并滤液，水浴蒸干，残渣加水5mL使溶解，边搅拌边缓慢滴加乙醇75mL，摇匀，于4℃放置12 h，离心，弃上清液，沉淀物用热水溶解，并转移至50mL容量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，取上述溶液适量，离心，精密量取上清液3 mL，置25 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 测定波长选择

取 D-无水葡萄糖对照品溶液，稀释成质量浓度为19.507 2 μg/mL的溶液，按标准曲线制备项下方法显色后，于585～625 nm波长范围内扫描，发现波长为625 nm时吸光度最佳，最终选择波长625 nm作为测定波长。

2.1.3 方法学考察

标准曲线绘制：精密量取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，分别置 10 mL 具塞试管中，加水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL，立即摇匀，放置15 min后，立即置冰浴中冷却15 min，取出，以相应试剂为空白，在625 nm波长处测定吸光度，以D-无水葡萄糖质量浓度(X，μg/mL)为横坐标，以吸光度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.045X-0.026，R2=0.997(n=7)，质量浓度线性范围为 26.00 ～182.00 μg/mL。

精密度试验：精密量取对照品溶液1.0 mL，置10 mL具塞试管中，依法测定吸光度，重复测定6次。结果的RSD为0.19%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液2.0 mL，按拟订方法置10 mL具塞试管中，依法测定吸光度6次，间隔时间5 min。结果的 RSD为1.10%（n=6），表明供试品溶液在30 min内稳定。

重复性试验：取同一样品5份，按拟订方法制备供试品溶液，精密吸取2.0 mL，置10 mL具塞试管中，依法测定吸光度值。结果平均含量为1.70%，RSD为1.60%（n=5），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品5份，每份1.0 g，精密称定，分别精密加入对照品溶液10.0 mL，按拟订方法制备供试品溶液，精密吸取2.0 mL，置10 mL具塞试管中，依法测定。结果见表2。

表2 多糖加样回收试验结果（n=5）

2.1.4 样品含量测定

同时测定5批供试品溶液，平行2次：精密量取供试品溶液2 mL，置10 mL具塞试管中，照标准曲线绘制项下方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的含量，计算，即得。结果见表3。

表3 不同厂家灵芝片中多糖、三萜及甾醇含量测定结果(%)

2.2 三萜及甾醇含量测定

2.2.1 溶液制备

对照品溶液：称取齐墩果酸对照品9.95 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为0.199 0 g/L的溶液，即得。

供试品溶液：取本品粉末约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙醇50 mL，超声处理（功率140 W，频率42 kHz）45 min，滤过，滤液置 100 mL容量瓶中，加适量乙醇，分次洗涤滤器和滤渣，洗液并入同一容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 测定波长选择

取齐墩果酸对照品溶液，稀释成质量浓度为115.920 0 μg/mL的溶液，按标准曲线绘制项下方法显色后，于506～586nm波长范围内扫描，根据扫描结果，最终选取546nm作为测定波长。

2.2.3 方法学考察

标准曲线绘制：精密量取对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，分别置 15 mL 具塞试管中，挥干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，摇匀，于70℃水浴中加热15 min，立即置冰浴中冷却5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，摇匀，以相应试剂作空白，在546 nm波长处测定吸光度，以样品质量浓度(X)为横坐标，以吸光度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程 Y=0.051X-0.014，R2=0.999(n=5)，质量浓度线性范围为 19.00 ～99.50 μg/mL。

精密度试验：精密量取对照品溶液0.5 mL，置15 mL具塞试管中，依法测定吸光度，重复进样6次。结果的 RSD为0.23%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液0.2 mL，按拟订方法置15 mL具塞试管中，依法测定6次，间隔时间 5 min。结果的 RSD为1.30%（n=6），表明供试品溶液在30 min内稳定。

重复性试验：取同一样品5份，按拟订方法制备供试品溶液，精密吸取0.2 mL，置15 mL具塞试管中，依法测定吸光度值。结果平均含量为0.99%，RSD为1.00%（n=5），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品5份，每份1.0 g，精密称定，分别精密加入对照品溶液5.0 mL，按拟订方法制备供试品溶液，精密吸取0.2 mL，置15 mL具塞试管中，依法测定吸光度值。结果见表4。

表4 齐墩果酸加样回收试验结果（n=5）

2.2.4 样品含量测定

同时测定5批供试品溶液，平行2次：精密量取供试品溶液0.2 mL，置15 mL具塞试管中，照标准曲线绘制项下方法，自“挥干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中齐墩果酸的含量，计算，即得。结果见表3。

3 讨论

紫外-可见分光光度法为常见定量方法[14]，因快速、简单、性价比高，且具有一定的稳定性和重复性，因此在中药质量分析中应用较多[14]。虽有文献表明，分光光度法与高效液相色谱（HPLC）法测定结果相差较大，分光光度法测定灵芝中总三萜的含量不能如实反映实际情况[15]，但三萜标准品的制备比较困难，至今还没有出现定量所有三萜的文章；二是结合厂家实际检测成本考虑，所以笔者参考2015年版《中国药典(一部)》灵芝的含量测定方法，采用紫外-可见分光光度法对5批灵芝片的多糖、三萜及甾醇进行含量测定。

5批灵芝片多糖测定结果均符合2015年版《中国药典(一部)》灵芝项下规定（应不小于0.90%），最高1.70%，最低0.94%，平均1.38%，取平均值的70%并结合2015年版《中国药典(一部)》制订灵芝片多糖含量限度，则灵芝片多糖含量以无水葡萄糖（C6H12O6）计，不得少于0.90%；三萜及甾醇测定结果同样符合2015年版《中国药典(一部)》灵芝项下规定（应不小于0.50%），最高0.99%，最低0.58%，平均0.73%。取平均值的70%并结合2015年版《中国药典》，制订灵芝片三萜及甾醇含量限度，则灵芝片三萜及甾醇含量以齐墩果酸（C30H48O3）计，不得少于 0.50%。

此外，本试验结果还显示，多糖、三萜及甾醇含量最高与最低相差近1倍，可能是不同种属、不同采收季节所致[16]；多糖含量高的样品，三萜及甾醇含量也相对较高，反之亦然。

综上所述，本研究中采用紫外-可见分光光度法对5批灵芝片进行多糖、三萜及甾醇的含量测定，方法可行、可靠、准确。