高效液相色谱外标法快速测定茶碱血药浓度

刘光斌，姜芳宁，高 颖，何苗苗

（酒钢医院，甘肃 嘉峪关 735100）

茶碱（theophylline）为甲基嘌呤类衍生物，主要用于治疗慢性哮喘。茶碱血药浓度个体差异大，有效范围为5～20 μg/mL，安全范围窄，治疗指数低，故有必要在其使用过程中监测血药浓度[1]。测定茶碱血药浓度的方法有高效液相色谱（HPLC）法、紫外法（UV）、气相色谱法（GC）、免疫测定法、高效毛细管电泳法（HPCE）等[1]。HPLC法检测成本低，专属性、灵敏度、分离度均良好，但文献报道大多采用内标法测定，且样品前处理过程需要萃取、复溶等复杂操作，技术性较强。本研究中采用直接沉淀蛋白法处理样品，并与内标法测定结果进行比较，结果显示外标法快速、简单，符合临床检测要求。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2010AHT型高效液相色谱系统，包括自动进样器、在线真空脱气机、四元高压泵及温控系统(日本岛津公司）；LC Solution工作站、AUW120D型十万分之一电子分析天平（日本岛津公司）。

1.2 试药

茶碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100121-199903）；甲醇为色谱纯，试验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Inertsil ODS-SP柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：甲醇 -水（20 ∶80，V ∶V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；进样量：20 μL。

2.2 溶液配制

茶碱标准溶液：称取茶碱对照品，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解后稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为39.6 μg/mL的茶碱贮备溶液，冰箱（4℃）存放，临用前用甲醇稀释成不同质量浓度。

茶碱标准血清样品及质控样品：取数支1.5 mL的离心管，精密加入不同质量浓度的茶碱标准溶液各0.1mL，分别加入空白血清0.5 mL，配制成相应质量浓度的茶碱标准血清样品及质控样品。

2.3 样品处理

精密量取血样0.5 mL，置1.5 mL离心管中，添加甲醇0.1 mL，再加5%高氯酸0.5 mL，涡旋混合10 min，以12 000r/min的速率离心10min，取上清液，用0.22μm微孔滤膜滤过，以40 μL为进样量，进样分析。

2.4 方法学考察

专属性试验：在拟订色谱条件下，茶碱的吸收峰约在7.7 min出现，峰形尖锐，基线平稳，杂峰不干扰测定（分离度大于1.5）。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：取数支1.5 mL离心管，分别精密加入 1.2，2.5，5.0，9.9，19.8，39.6 μg/mL 系列质量浓度的茶碱标准溶液，以茶碱血清药物质量浓度（C）对应峰面积（A）进行线性回归，得回归方程 C=2.416 85×10-5A+0.378 36，r=0.999 9(n=6)。结果表明，血清中茶碱质量浓度在1.2～39.6 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。茶碱的有效血药浓度为5～20 μg/mL，此范围可以满足临床检测需要。茶碱的最低检测限为0.4 μg/mL（信噪比以 S/N=3 ∶1 计）。

回收率和精密度试验：取1.5 mL离心管数支，分别取茶碱标准溶液适量，置离心管中，添加空白血清0.5 mL，配制成 5.0，19.8，39.6 μg/mL 3 种质量浓度的茶碱血清样品。每个样品测定5次，以平均值作为测定值，用测定值和实际值计算回收率。3种质量浓度的溶液同一日内测定5次计算日内精密度，连续5日内每日测定1次计算日间精密度。结果见表1。

表1 回收率和精密度试验结果

稳定性试验：参照文献[2]，取数支1.5 mL离心管，精密加入质量浓度分别为5.0，19.8，39.6 μg/mL的茶碱质控样品0.25 mL，平行制备5份。第1份按血清样品处理方法处理后即刻（时刻A）进样；第2份室温条件放置4 h，按血清样品处理方法处理后（时刻B）进样；第3份在4℃放置24 h，按血清样品处理方法处理后（时刻C）进样；第4份置冰箱内冷冻4周后取出，融化，按血清样品处理方法处理后（时刻D）进样；第5份在4周内冻、融3次，再按血清样品处理方法处理后（时刻E）进样。结果见表2。

表2 血清中茶碱稳定性试验结果

2.5 内标和外标法测定结果比较

分别取 5.0，19.8，39.6 μg/mL 质量浓度的茶碱血清样品溶液，用本研究方法和文献方法（内标法）[3]分别测定，结果见表3。经 t检验，两种方法测得的回收率比较，差异无显著性（P>0.05）。取服用茶碱的患者血样20份，分别用本研究方法和文献方法（内标法）[3]测定，结果经 t检验，两种方法测得值比较，差异无显著性（P>0.05）。

表3 内标法与外标法测定结果比较

3 讨论

模拟临床常用联合用药，将哮喘患者及COPD患者常用的各种药物与茶碱进行混合测定，结果发现诸多常用药物均不干扰茶碱血药浓度的测定，说明本方法特异性较高。

据报道，茶碱血药浓度检测使用的波长有273，254，210 nm等，其中以270 nm左右居多[3-5]。对不同波长分别进行比较，发现波长为270 nm时其他组分对茶碱的干扰较小，色谱响应较强，灵敏度高。

用5%高氯酸、乙腈和甲醇分别作为血清蛋白沉淀剂进行试验，结果单纯使用5%高氯酸沉淀时色谱图中段有馒头样峰出现，且基线不稳定；选用乙腈、甲醇时回收率达不到要求；最终采用5%高氯酸和甲醇联合作为沉淀剂时回收率达标、基线稳定。5%高氯酸的用量参照文献使用标本量的80%[6]。

血药浓度测定因前处理步骤烦琐，需用内标法校正，但也有文献提出内标法需要加入其他物质作为内标，增加操作步骤而增加了操作误差，因此内标法未必能明显改善血药浓度检测方法的精密度[7]。本研究中建立的外标法与文献报道的内标法[3]的测定结果均接近理论值，且无显著性差异（P>0.05），说明两种测定方法可互相替代。本研究中使用外标法进行过诸多药物血药浓度的研究，结果均较满意[8-10]。

有文献报道，HPLC法测定茶碱血药浓度时选择的流动相有0.03 mol/mL磷酸盐-乙腈-水[4]、甲醇-0.05 mol/mL硫酸锂[11]、甲醇-水-0.1%三氟乙酸[12]等。本研究中采用甲醇和水为流动相，不需使用其他盐和酸，故成本较低、操作简单，为较理想的检测方法。