干旱预处理对一年生黑麦草耐盐性的影响

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(西北农林科技大学动物科技学院， 陕西 杨凌 712100)

土地盐渍化是全球广泛存在的问题。在世界范围内，盐渍化土地面积以每年约106hm2的速度迅速增加。我国盐碱地面积己达9.9×107hm2，且仍以惊人的速度增长[1-2]。盐胁迫严重影响植物生长，在一些地区导致作物产量大幅下降[3]。长期以来人们对盐胁迫下植物抗性生理进行了深入研究，尝试通过传统育种方法和现代生物技术来提高作物耐盐性，并取得一定的成果。

自然条件下，植物往往受到多种逆境的影响。当植物同时遭受两种以上的逆境因素胁迫时，所受到的伤害往往大于单一逆境。但是，如果逆境胁迫前后发生，植物在受到第一种不良环境影响后，能够产生抵抗其他不良环境的能力，即植物对逆境胁迫存在交叉适应[4]。如水分亏缺可增加常绿杜鹃[5]等植物的抗寒性；低温预处理可以提高马铃薯对线虫病害的抗性[6]，因此对植物进行某种逆境胁迫的预处理可作为增强植物抗逆性的一种策略。同样的，对植物应用低温[7]及NO[8]等预处理，也可以提高植物的耐盐性，但是，有关干旱预处理是否能够提高植物的耐盐性的研究较少。

一年生黑麦草(LoliummultiflorumLam.)是禾本科黑麦草属的一年生草本植物，是世界上广泛栽培的优质牧草和草坪草。与大多数植物一样，一年生黑麦草生长过程中会遭受多种逆境的胁迫。目前，关于一年生黑麦草在干旱、盐渍等单一逆境下的抗性生理研究较多，但对于黑麦草对这两种逆境产生的交叉适应的报道较少。本试验旨在探究干旱处理是否能诱导一年生黑麦草对盐胁迫的耐受性，利用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)模拟干旱对一年生黑麦草进行单一的以及经干旱预处理后的盐胁迫和盐旱复合胁迫，研究一年生黑麦草相应抗性生理指标的变化情况，讨论干旱预处理影响耐盐性的生理机制，从而为盐渍化土地中一年生黑麦草的栽培管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料培养

试验于2017年3月16日在西北农林科技大学动物科技学院进行。供试的一年生黑麦草草种由阿里种业有限公司提供。

挑选饱满且大小均一的种子，用15%H2O2浸种消毒10 min后，用蒸馏水冲洗4～5次，置于铺有两层灭菌滤纸的培养皿中，于25℃光照培养箱中萌发，待长出子叶后移至装有石英砂的塑料花盆中(口径92 mm，底径62 mm，高120 mm)。移栽后，置于温度22.5℃、光照强度5 000 lx、光照时长14 h的培养室内。每天浇水，每隔两天补充Hoagland营养液。待幼苗长至约25 cm左右时进行处理。

1.2 试验材料处理

一年生黑麦草幼苗分为6组(每组5次重复)并按照以下方式处理：

(1)对照组(CK)：浇水和营养液6 d；

(2)单一盐处理组(2% NaCl)：浇水和营养液3 d后，进行2%的NaCl胁迫处理3 d；

(3)5% 聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)预处理组(5%PEG-NaCl)：5%PEG处理3 d后，进行2%NaCl胁迫处理3 d；

(4)10% PEG预处理组(10% PEG-NaCl)：10%PEG处理3 d后，进行2%NaCl胁迫处理3 d；

(5)5% PEG+2%盐组(5% PEG+NaCl)：浇水和营养液3 d后，进行5%PEG和2%NaCl同时处理3 d；

(6)10% PEG+2%盐组(10% PEG+NaCl)：浇水和营养液3 d后，进行10%PEG和2%NaCl同时处理3 d。

处理完成后刈割植株的地上部分进行各项生理指标的测定。

1.3 试验指标和测定方法

1.3.1相对含水量的测定 取黑麦草鲜样在万分之一天平上进行第一次称重(M1)，再将样品浸入蒸馏水中24 h并称其饱和重(M2)，随后在烘箱内105℃杀青30 min后，然后在75℃烘干至恒重(M2)。相对含水量(%) = (M1- M3)/ (M2- M3) ×100%。

1.3.2叶绿素含量的测定 采用80%丙酮提取叶绿素[9]。后用紫外可见分光光度计(UV-6100S型，MAPADA,中国)在波长645 nm和663 nm下测定吸光度，利用公式：叶绿素含量(mg·g-1FW)= (20.29A645+ 8.05A663) ×Vt×n/(1000×FW)计算单位鲜重(fresh weight, FW)的总叶绿素含量。其中Vt为提取液总体积(ml)，下同；n为稀释倍数。

1.3.3丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)含量的测定 采用硫代巴比妥酸(TBA)法[9]。以0.5%TBA溶液为空白对照，测定450 nm、532 nm和600 nm处的吸光值，用公式：MDA(μmol·g-1FW)= [6.452×(A532- A600) - 0.559×A450] ×Vt/(Vs×FW)计算MDA含量。其中，Vs为测定所用提取液体积(ml)。

1.3.4钠离子和钾离子含量的测定 取黑麦草叶片鲜样，用去离子水洗净，烘干，取0.1 g烘干样品，将样品加入至消煮管中，再加入1 ml过氧化氢和5 ml硝酸，放在消煮炉上消煮至澄清。消煮后液体过滤进100 ml容量瓶中，用超纯水定容，用火焰光度计(M410，sherwood，英国)及原子吸收分光光度计(PinAAcle，PE公司，美国)分别测定钾离子以及钠离子的浓度。

1.4 数据分析

试验数据均用平均值表示，利用SAS 8.0对数据进行One-Way ANOVA方差分析，并使用Duncan’s法进行差异显著性检验(P<0.05)，图表采用Excel进行绘制。

2 结果与分析

2.1 相对含水量

从图1可以看出，与对照组相比，各处理组相对含水量均有不同程度的降低，其中2% NaCl处理和5% PEG预处理分别较对照组降低了0.21%和1.21%，差异未达显著水平；而10% PEG处理较对照组减少了25.61%，差异显著(P<0.05)；在PEG和NaCl同时胁迫下，黑麦草的相对含水量显著低于对照组(P<0.05)，虽略高于10% PEG预处理组，但差异不显著。

图1 不同处理下一年生黑麦草的相对含水量Fig.1 Relative water content of annual ryegrass under different treatments注：不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)， 误差线代表标准差，下同Note: Different letters indicate significant differences among treatments at the 0.05 level, error bars represent standard error, the same as below

2.2 叶绿素含量

对照组叶绿素含量为9.31 mg·g-1FW，2% NaCl组的叶绿素含量较对照组减少了2.67%。PEG和NaCl同时胁迫使叶绿素含量进一步下降，其中，10% PEG+NaCl较对照组下降了19.99%(P<0.05)。经PEG预处理后叶绿素含量有所增加，虽与对照组之间差异未达显著水平，但5%PEG-NaCl组中的叶绿素含量显著高于单一盐胁迫组和同时胁迫处理组(P<0.05)(见图2)。

2.3 MAD含量

各处理组MDA含量较对照组均有不同程度的升高，但差异不显著。对照组MDA含量约为0.720 μmol·g-1FW，2%NaCl组与对照组相比增加了30.22%。5%PEG和10%PEG与盐同时处理组中MDA含量分别为35.96%和39.53%，增幅最大。而5%PEG和10%PEG预处理组MDA含量增幅最小，仅比对照组增加了4.91%和8.75%。(图3)

图2 不同处理下一年生黑麦草的叶绿素含量Fig.2 Chlorophyll content of annual ryegrass under different treatments

图3 不同处理下一年生黑麦草中MDA含量Fig.3 MDA content in annual ryegrass under different treatments

2.4 钾离子、钠离子含量及钠钾比

与对照组相比，除10% PEG预处理组中黑麦草K+含量显著增加41.38%(P<0.05)外，其他处理组K+含量均无显著变化(图4A)；而Na+含量在各处理组均有显著升高(P<0.05)，其中以2% NaCl处理增幅最大，与对照组相比Na+浓度提高了5.28倍，以5% PEG-NaCl组增幅最小(1.5倍)，其Na+含量显著低于其他处理组(P<0.05)(图4B)。

与对照组相比，各处理组Na+/K+均显著增加，其变化趋势与Na+含量的变化相似，以2% NaCl组增幅最大，而5% PEG-NaCl组增幅最小，其Na+/K+显著低于2% NaCl组、10% PEG-NaCl组和5% PEG+NaCl组(P<0.05)，但与10% PEG+NaCl组间差异未达显著水平(见图4C)。

图4 不同处理下一年生黑麦草的钾离子含量(A)、 钠离子含量(B)及钠钾比 (C)Fig.4 The potassium content (A), sodium content (B) and potassium ratio (C) of the annual ryegrass under different treatments

3 讨论

盐胁迫下植物生长受到抑制、多种生理生化过程发生变化，使植物正常发育受到干扰[10-11]。当植物受到双重胁迫时，其伤害更大[12]。本试验中，在单一盐及盐旱双重胁迫下，植物的相对含水量下降、叶绿素含量减少，Na+离子、MDA含量增加，对一年生黑麦草造成了不良影响。但经5% PEG预处理后，与单一盐逆境相比，黑麦草通过增加叶绿素含量以及维持钠离子钾离子平衡，在整体上增强了耐盐性，而10% PEG预处理对植物耐盐性的影响不明显。

土壤溶液的水势低于植物细胞水势是造成植物含水量下降的原因之一，使植物根系吸水困难，导致相对含水量降低[13]。PEG和NaCl均降低了溶液的水势，使得黑麦草吸水困难，造成一定程度的失水(图1)。试验中，5% PEG预处理组植物的含水量与NaCl单独处理组相比无显著差异，5% PEG预处理无法有效缓解盐胁迫下黑麦草含水量的下降。

在盐胁迫下，植物多种生理过程失调，如膜系统受损、有害物质累积等[14]，会使植物体内叶绿素酶活性增强[15]，过量的盐离子会破坏类囊体结构和色素蛋白复合体的稳定性[16]，这些因素均会导致植物叶绿素的减少。在本试验中，PEG+NaCl组也表现出了叶绿素含量的显著降低，其中10% PEG+NaCl组降幅最大。而5% PEG处理有效地缓解了盐胁迫下植物叶绿素含量的下降，能在一定程度上增加植物对盐分胁迫的耐受性，Ma[17]等人在对水稻的研究中也得到了相似的结果，可能因为5% PEG预处理有效阻止了盐胁迫下植物体内Na+含量的增加，减轻了Na+对植物光合系统的负面影响[18]。值得注意的是，5% PEG预处理组的叶绿素含量与对照相比略有升高，这可能是该处理组植物耐盐性增加所诱导的对盐胁迫的响应，姚晓华等对青稞幼苗的研究也有着相似的结果[19]。

植物在受到逆境胁迫时会造成细胞膜脂过氧化并产生MDA，植物的MDA含量是衡量膜脂过氧化程度的重要指标，并能间接反映膜系统受伤害的情况。盐胁迫导致植物体内活性氧的产生与清除失调，活性氧增加，使膜脂过氧化产生MDA，膜系统的完整性遭到破坏，影响细胞膜的选择透性，进而对细胞造成不可逆的损伤，阻碍各种代谢活动的正常进行[10]。本试验结果显示，各处理间MDA含量差异均不显著，盐胁迫下黑麦草MDA含量略有增加，而 PEG预处理降低了盐胁迫下MDA含量，这与康建宏等[20]在玉米幼苗干旱预处理对逆境的交叉适应中的研究结果相似，说明PEG预处理能够减轻盐胁迫下的活性氧对膜系统的破坏，维持细胞膜正常的结构功能。大量研究已证明MDA含量的减少与细胞内抗氧化酶有关，梅映学等[21]在对水稻的研究中发现，经过干旱预处理后植物细胞内CAT，SOD，POD和APX等抗氧化酶活性升高，增强了抗氧化酶系统清除活性氧的能力，从而减少了膜脂过氧化程度，提高黑麦草的耐盐能力。

在盐胁迫下，通常涉及渗透胁迫和离子毒害，Na+是盐渍化土壤中的主要毒性离子之一，高浓度Na+影响细胞膜的选择透性，使细胞内一些必需元素外渗，破坏细胞内离子平衡[22]。Parida和Das[23]研究指出控制植物对Na+的吸收并阻止其向地上部分运输是植物耐盐机制之一。试验中，PEG减少了Na+的毒害，其中，5% PEG的作用显著大于10% PEG。在植物的耐盐性中，K+在植物体和细胞水平上维持渗透平衡有着重要的作用，也是代谢过程中多种酶的激活剂，高浓度盐诱导组织内K+含量降低是造成盐害的主要原因之一[24]。此外，大量研究发现，植物遭受干旱胁迫时细胞内K+积累，如干旱胁迫引起甜菜幼叶内K+含量增加[25]。本研究中，盐胁迫对K+含量影响较小，经PEG预处理后K+含量升高，但变化不显著。可能由于盐处理时间较短，各处理组之间K+差异不明显。此外，植物体内Na+与K+的比例(Na+/K+)也影响着植物的生理过程，其中细胞质内较低的Na+/K+对维持多种酶促过程是至关重要的，本试验中5% PEG预处理能有效缓解盐胁迫对Na+/K+的影响，10% PEG预处理也有一定的缓解作用，其中黑麦草对Na+吸收的控制起着重要作用，这与Cayuela等[26]对番茄的研究结果相似。

对于交叉适应现象的机理，没有统一的理论解释。干旱预处理降低了盐胁迫对植物的伤害，主要表现在降低离子毒害，干旱会增加植物渗透调节物质的积累，比如糖、脯氨酸等，导致渗透势降低[27]，从而减少Na+的吸收；干旱也会增加抗氧化酶的活性，从而减少盐胁迫下MDA的生成及叶绿素的分解[28]。而干旱本身对植物也会造成失水和MDA增加等伤害[29]，当干旱高于一定程度时，其自身造成的伤害大于对盐害所起的缓解作用，因此，本试验中5% PEG预处理的效果显著优于10% PEG。

4 结论

单一盐和盐旱双重胁迫均对植物造成了伤害，而双重逆境的伤害远远大于单一胁迫。但对于一年生黑麦草来说，干旱预处理可通过增加叶绿素含量、减少Na+含量以及维持Na+/K+平衡提高其抗盐性。此外，干旱预处理也会降低植物的含水量，因此，在应用干旱预处理时，需注意干旱持续的时间及程度；其次，本试验仅讨论在短期盐胁迫下PEG预处理对一年生黑麦草耐盐性的影响，对于黑麦草在长期盐胁迫的生理响应还需要进一步研究。