干旱脱水对狗牙根叶片光合机构的影响

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(新疆农业大学草业与环境科学学院，新疆草地资源与生态实验室，新疆 乌鲁木齐 8320052)

狗牙根(CynodondactylonL.)为禾本科多年生草本，是暖季型草坪草中应用最广的草种之一，因其具有生长速度快、再生能力强、成坪快、耐热、耐践踏、色泽好等优点，被国内外广泛应用于运动场、游憩场及固土护坡[1]。近些年来，随着全球变暖和环境恶化，干旱问题日益严重。狗牙根由于其生境特点，常常遭受干旱胁迫，生长和发育受到限制。

光合作用是植物生长发育所需能量的主要来源，干旱胁迫下，植物水分大量散失，导致植物组织脱水。叶片遭受轻度脱水后气孔关闭，光合作用受限；叶片重度脱水会导致植物组织结构受损、代谢受抑加重植物光合作用的非气孔限制，从而使植物光合作用严重下降[2-3]。干旱脱水常常伴随着其他胁迫如高温[4]、强光[5]、盐胁迫[6]等的发生，多重胁迫下，光合作用受抑，会导致脱水叶片光抑制加重，活性氧大量积累从而对光合机构产生不可逆的伤害。但目前对于脱水胁迫直接伤害叶片光合机构的了解较少。

光合机构由光系统1(PSⅠ)和光系统2(PSⅡ)共同组成，二者相互作用。当PSI和PSII之间的电子传递被抑制，会导致PSII受体测电子传递受阻，同时导致PSI受体侧电子供应不足。PSⅠ活性下降时，PSII流向PSI的电子被阻断，在光下会导致PSII产生大量活性氧，加重PSⅡ光抑制。由于PSⅠ研究手段的限制，此前关于光合机构对于干旱脱水的响应多集中于PSⅡ[7-8]。脱水胁迫是否会伤害PSⅠ活性，以及脱水是否会影响PSⅠ和PSⅡ之间的相互作用，这些问题有待解决。

植物对820nm光的吸收反映了PSⅠ的氧化还原能力，因此利用植物对820nm光的吸收技术可以分析PSⅠ光化学活性的变化[9-10]。快速叶绿素荧光测定和分析技术(JIP-test)可以快速分析PSⅡ光化学活性的变化。本实验利用这两种技术，研究了脱水胁迫对狗牙根叶片PSⅠ和PSⅡ及其两者之间相互作用的影响，为狗牙根的抗旱育种及新品种推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试叶片取自新疆农业大学试验场建成草坪，清晨日出之前选取生长健康、长势一致的叶片用于实验处理。

1.2 叶片脱水处理

为了排除光合电子传递链介导的活性氧的伤害，本实验在黑暗室温下进行。黑暗条件下，将10片新农1号狗牙根(CynodondactylonL. ‘Xin nong No.1’)叶片悬挂在均匀流动的空气中进行脱水处理，在28℃下脱水25小时直到叶片相对含水量下降到约25%左右。对照组用湿纱布包裹，相同条件下处理相同的时间。

1.3 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线

参考Strasser等[10]的方法，叶片先暗适应20 min，然后利用M-PEA(Hansatech, 英国)测定叶片快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(O-J-I-P曲线)。O-J-I-P荧光诱导曲线用JIP-test进行分析，计算以下参数：

PSII的最大光化学效率Fv/Fm=φPo =1-( Fo/Fm)；J点标准化后的相对可变荧光 Vj=(Fj-Fo)/(Fm-Fo)；PSII反应中心捕获的光能中进入电子传递链的概率ψO= ETo/TRo=1-Vj；单位面积吸收的光能ABS/CSm=Fm；光合性能指数PIABS=(RC/ABS)·[φPo/(1-φPo)]·[ψO/(1-ψO)]。

1.4 P700活性的测定

P700活性根据Schansker等[9]的方法使用PEA Senior(Hansatech，英国)进行测定，用△I/Io反映PSI活性。

1.5 叶片相对含水量的测定

叶片离体后立刻测定鲜重，水中浸没12小时后测定饱和鲜重，然后在鼓风烘箱中在 80℃烘干48小时，测定干重，用如下公式计算得出处理前叶片的相对含水量(relative water conter,RWC)约为83%。

计算公式：RWC(%)=(鲜重-干重)/(饱和重-干重)

试验叶片离体后及脱水处理不同时间后测定鲜重，脱水处理结束后将叶片放入鼓风烘箱中在 80℃烘干48小时，测定干重，以脱水处理前叶片的相对含水量为83%计算不同脱水时间叶片的相对含水量。

1.6 叶片叶绿素含量的测定

取狗牙根叶片，剪碎，称取2 g左右，放入刻度试管中，加10 ml乙醇：丙酮(1:1)混合液于黑暗条件下浸提24小时。用CS-190分光光度计测定吸光值，以丙酮为空白，在波长为665 nm、649 nm和470 nm进行比色，按照如下公式进行计算：

叶绿素a(Chl a /μg·g-1)=(12.7*A663—2.69*A645)/100*DW

叶绿素b(Chl b /μg·g-1)=( 22.9*A645—4.68*A663)/100*DW

类胡萝卜素(Caretenoid /μg·g-1)=[4.7*A440—0.27*(Chl a-Chl b)]/100*DW

1.7 数据分析

采用Microsoft Excel 2003 软件统计分析数据，用Sigma plot作图。所有数据均为10次重复测定的平均值。

2 结果与分析

2.1 脱水对狗牙根叶片相对含水量的影响

在室温黑暗下，随着脱水的进行，叶片RWC呈线性逐渐下降，最终下降到25%左右；对照组经过相同时间处理，相对含水量无显著下降(图1)。

图1 黑暗脱水处理不同时间后叶片相对含水量随处理时间的变化。每个数据均为10次重复的平均值Fig.1 The RWC in Cynodon dactylon L. leaves dehydrated at 28℃ in the dark for different times. Each value is the mean±SE(n=10)

2.2 脱水对狗牙根叶片色素含量的影响

叶片光合机构是一个高度密集的多亚单位色素蛋白复合体。从图2 观察到，脱水胁迫导致狗牙根叶片叶绿体色素a、b和类胡萝卜素含量显著下降，其中叶绿素a下降程度最大。这表明，脱水胁迫会导致叶绿素降解，从而导致叶片光合机构的数量减少。

图2 黑暗脱水处理对叶片叶绿素a(Chl a)、叶绿素b (Chl b)和类胡萝卜素(Car)含量的影响。每个数据均为10次重复的平均值Fig.2 Effects of dehydration treatments on content of Chl a, Chl b, Car in Cynodon dactylonL. leaves. Each value is the mean±SE(n=10)

2.3 脱水对狗牙根叶片PSⅡ光化学活性的影响

快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线)被广泛应用于PSII活性研究中[9-11]。在进行O-P点标准化的曲线中(图3)，脱水处理前叶片呈现出了典型的OJIO曲线，而随着不同脱水时间的处理，叶片的OJIP曲线出现显著差异。脱水处理后的叶片OJIP曲线上的J点(2 ms)和I点(30 ms)荧光都有上升。随着脱水处理时间的延长，J点和I点上升程度增加。

图3 脱水处理不同时间对离体叶片OJIP曲线的影响.OJIP曲线按照Vt=(Ft-Fo)/(Fm-Fo)进行标准化(A)，B图为脱水不同时间与处理前的曲线的差值ΔVt=Δ(Vt-Vt0h)Fig.3 Effects of dehydration treatment on OJIP curve of isolated leaves at different time. The OJIP curve is normalized according to Vt = (Ft-Fo)/(Fm-Fo) (A). B is the difference ΔVt=Δ(Vt-Vt0h) between the dehydration time and the curve before treatment

PSII供体侧受到伤害即放氧复合体(OEC)伤害时，OJIP曲线的300 μs处出现的K点会上升。为了观察K点，我们将OJIP曲线进行O-J点标准化(图4)，发现脱水处理后叶片的OJIP曲线K点均呈上升趋势，脱水到25 h后，K点显著上升。

图4 脱水处理不同时间对离体叶片OJIP曲线的影响OJIP曲线按照Wt=(Ft-Fo)/(Fj-Fo)进行标准化(A)，B图为脱水不同时间与处理前的曲线的差值ΔWt=Δ(Wt-Wt0h)Fig.4 Effects of dehydration treatments on theOJIP curve of isolated leaves at different time. The OJIP curve was normalized according to:Wt=(Ft-Fo)/(FJ-Fo)(A), and B is the differences of ΔWt=Δ(Wt-Wt0h) between the dehydration time and the curve before treatment

叶片最大光化学效率Fv/Fm反映PSII天线吸收的光能被反应中心捕获的概率，图5A表明，随着脱水的进行，叶片最大光化学效率都逐渐下降，但当叶片RWC降至25%时，Fv/Fm仅下降到对照组的10%左右。电子传递到QA以下的效率(Ψo，图5A)反映被PSII反应中心捕获的能量进入电子传递链的概率，随着脱水时间的增加，处理叶片的Ψo均有下降，并且在脱水处理10 h后，Ψo大幅下降。单位面积吸收的光能(ABS/CSm，图5A)反映PSII 天线吸收光能的能力，随着脱水处理，叶片ABS/CSm逐渐下降，与Ψo相似，在脱水10 h后大幅减小。随着脱水进行，光合性能指数(PIABS，图5A)逐渐下降，与Fv/Fm相比，下降程度更大，对脱水胁迫更敏感。

为进一步阐明PSII光化学活性与叶片脱水状态之间的关系，我们研究了PSII活性相关参数随叶片RWC的变化。随着叶片RWC逐渐下降，叶片Fv/Fm、Ψo、ABS/CSm和PIABS都逐渐下降，其中，叶片RWC对叶片Fv/Fm的影响最小，叶片光合性能指数PIABS对于叶片RWC最敏感。由图5B可知，叶片RWC下降到60%之前，对Fv/Fm、Ψo、ABS/CSm影响较小，当叶片RWC下降到60%之后，Fv/Fm、Ψo、ABS/CSm开始大幅下降。

图5 脱水处理后叶片Fv/Fm,Ψo, ABS/CSm和PIABS随处理时间(A)和叶片相对含水量(B)的变化。处理前Fv/Fm和Ψo的值被作为100%，处理后的Fv/Fm和Ψo换算为处理前值的百分比。每个数据均为10次重复的平均值Fig.5 The changes of Fv/Fm, Ψo, ABS/CSm and PIABS after treatment with time (A) and RWC (B) of the leaves.The values of Fv/Fm and Ψo before treatment were taken as 100%, and the Fv/Fm and Ψo after treatment were converted into percentages of the value of before treatment. Means ± SE of 10 replicates are presented

2.4 脱水对狗牙根叶片PSⅠ活性的影响

叶片820 nm光吸收技术广泛应用于叶片PSI的活性研究中[9,12]。图6A表明，在脱水初期即处理时间小于10 h时，PSI光化学活性维持在较高水平，随后叶片PSI活性大幅下降，图6B表明，从叶片RWC下降到60%之前， ΔI/Io几乎不随叶片RWC下降而变化，但叶片RWC小于60%时，PSI活性急剧下降。

为了阐明叶片脱水过程中两个光系统之间的相互作用和光合电子传递链的变化，利用同时测定的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线和820 nm光吸收曲线，分析了在相同脱水状态下，PSI和PSII光化学活性的相对变化。从图6可以得出，在脱水过程中，PSII最大光化学效率Fv/Fm以及被PSII反应中心捕获的能量进入电子传递链的概率Ψo逐渐下降，但是下降程度较小，当PSII光化学活性仍处于较高水平时，叶片PSI活性大幅下降。这说明，脱水胁迫对于狗牙根叶片光合机构PSI的破坏早于对PSII的破坏。

图6 脱水处理不同时间后叶片ΔI/Io随处理时间(A)、叶片相对含水量(B)的变化、Fv/Fm(C)和Ψo(D)的变化。处理前Fv/Fm，Ψo和ΔI/Io的值被作为100%，处理后的Fv/Fm，Ψo和ΔI/Io换算为处理前值的百分比。每个数据均为10次重复的平均值Fig.6 The activity of the PSI complex (ΔI/Io) in leaves under dehydration treatment for different time (A) and different RWC (B). The activity of the PSI complex (ΔI/Io) (C) and maximum quantum yield of PSII (Fv/Fm, A) (D). ΔI/Io and exciton efficiency of electron transport beyond B) in leaves under dehydration treatment. The initial value of ΔI/Io, Fv/Fm and ΨObefore treatment were taken as 100%, and those after treatment were calculated as percentages of the initial value. Means ± SE of 10 replicates are presented

3 讨论

脱水对于叶片Fv/Fm影响较小，但会引起PSI活性大幅下降，这表明狗牙根叶片PSI对于脱水胁迫更敏感，而脱水胁迫对于PSII最大光化学效率(Fv/Fm)影响较小，Georgieva等研究表明叶片PSII光化学活性对于脱水有一定的抗性[13]。Fv/Fm只表示PSII反映中心对吸收光能的捕获效率，而并不能全面的反映整条电子传递链对于胁迫的响应。ABS/CSm反映了光合机构对于光能的吸收，脱水降低了叶片的ABS/CSm，这表明脱水改变了天线色素的结构或使天线降解。光合性能指数(PIABS=(RC/ABS)·[φPo/(1-φPo)]·[ψO/(1-ψO)])反映了整条光合电子传递链对光能的捕获以及电子传递整个过程，更准确的反映了植物光合电子传递链的状态[14]。在脱水初期，ABS/CSm，Ψo以及Fv/Fm 均无显著下降，但PIABS却显著下降，随着脱水程度的加重，ABS/CSm和Ψo下降程度都小于PIABS的下降程度。这表明脱水直接影响了狗牙根叶片光合机构的光合性能。

4 结论

干旱脱水胁迫导致狗牙根叶片光合机构数量以及活性下降，限制了叶片的光合作用，最终影响狗牙根的生长和发育。在狗牙根实际栽培生产过程以及抗旱品种的选育过程中，光合性能指数(PIABS)可以作为一种筛选指标，快速有效的反映干旱胁迫对于狗牙根叶片的影响。