对乙酰氨基酚对不同妊娠期小鼠肝肾功能的影响及机制研究

俸 珊，俸 娜，付玉颖，邹 利，刘 珂，任 巧，徐晓玉

(1. 西南大学药学院，重庆 400715；2. 成都市青白江区人民医院重症监护病房，四川 成都 610300)

Fig 1 Formation of reactive NAPQI from APAP and relatedmechanism for induced hepatotoxicity

妊娠后，体内激素水平会随着妊娠周期有所波动，而该波动会影响肝脏CYP450s活性水平。研究显示，妊娠期间肝脏CYP2C9、2D6、2E1、3A的活性均会上调[3-4]，故孕期用药药物药代动力学参数的变化一直是研究的热点。早在1986年，Miners等[5]便报道了孕期APAP的口服清除率较非孕期高58%。随后Larrey等[6]也发现，给予妊娠17～18 d小鼠400 mg·kg-1APAP后，24 h小鼠肝脏转氨酶水平升高。Neto等[7]于2004年报道了长期给予妊娠大鼠1 500 mg·kg-1APAP(从妊娠d 1到妊娠结束)后，母体及胎儿的肝脏和肾脏均有明显损伤。Thiele等[8]发表的荟萃分析也表明，过量APAP对妊娠期母体和胎儿均存在较大风险。FDA颁布的妊娠用药指南中，将APAP纳入B级(B级：副作用在动物繁殖性研究中得到证实，而不曾在已妊娠3个月的孕妇中证实)。Franko、Thornton等[9-10]分别在2013和2012年报道了妊娠中期孕妇过量服用APAP导致肝移植的病例，APAP孕期安全性评价又重新引起关注[11]。目前并无直接证据表明妊娠中期和晚期肝脏对APAP的耐受性有差异，同时，肾脏作为APAP的主要排泄器官，单剂量APAP是否会引发孕期肾损伤也未知。鉴于APAP妊娠用药的生殖毒性，以及对子代行为学影响已研究较多，本研究将主要关注 APAP 500 mg·kg-1(正常小鼠的最大可耐受剂量[8])对不同妊娠时期(未妊娠时期、妊娠中期、妊娠晚期)母鼠肝肾功能的影响，同时探究相关机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 APAP购于中国食品药品检定研究院, 纯度>99%；谷丙转氨酶 (alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶 (aspartate aminotransferase, AST)、碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)、肌酐(creatinine，Cre)、尿素氮(urea nitrogen, BUN)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、GSH、丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.2实验动物 SPF级昆明小鼠120只，体质量 (20 ± 2) g，购自重庆中药研究院，生产许可证号：SCXK(渝)2017-0003。

1.1.3仪器 API 4000 Qtrap(2台岛津LC-20AD泵，ESI接口离子源，Analyst Software 1.5.1色谱工作站)；BS-220全自动生化分析仪(深圳迈瑞)；超高速离心机(美国Thermo Scientific 公司)。

1.2孕鼠的制备将♀鼠和♂鼠按照2 ∶1合笼饲养，并于合笼后的每日清晨、中午及晚上检查♀小鼠是否出现阴栓(作为判断受孕的直接证据)；同时做阴道涂片观察小鼠的动情周期。阴栓是小鼠在交配后形成的白色浆状物质，堵塞于阴道腔内，是动物已交配的标志，本研究将阴栓出现当天作为妊娠“0 d”。

1.3实验分组实验分为未妊娠组、妊娠中期组(受孕后7～15 d，本实验采用受孕后10 d小鼠)、妊娠晚期组(受孕后15～21 d，本实验采用受孕后18 d小鼠)。灌胃给予上述各组小鼠APAP 500 mg·kg-1，并于给药后0(不同妊娠期各自空白对照组)、6、24、48 h后取材。给药结束后，动物禁食不禁水，并于各时间点摘眼球采血，进行血清生化指标检测。同时取部分肝、肾组织，固定于4%多聚甲醛溶液中，以备后续病理切片。其余的肝组织-80℃冰箱保存待用。

1.4血清生化指标的检测ALT、AST、ALP、Cre、BUN等血液生化指标采用全自动生化分析仪检测。

1.5肝、肾组织氧化应激指标的检测肝、肾组织中SOD、GSH、MDA 含量按照南京建成试剂盒说明书测定。

1.6肝、肾组织HE病理切片制备将固定液中肝、肾组织石蜡包埋, 切片, 苏木精-伊红 (hematoxylin-eosin, HE) 染色后, 光学显微镜下观察病理学变化。

1.7小鼠肝微粒体的制备每份肝、肾取0.1 g，即每组各0.5 g，加入3倍体积冰冷的PBS匀浆，3 500 r·min-1离心30 s(离心2次)。弃去沉淀和上层白色物质。将上清液装入特制离心管中，PBS配平至误差在0.01 g以内，超高速离心(105 000×g，60 min)，所得沉淀用pH 7.4的Tris缓冲液重悬浮，得到肝微粒体溶液，BCA试剂盒法测定其蛋白含量。

1.8“Cocktail”探针法检测CYP450s活性[12]向50 μL探针药物(其中右美沙芬2.5 μmol·L-1、非那西丁10 μmol·L-1、甲苯磺丁脲100 μmol·L-1、氯唑沙宗20 μmol·L-1、咪达唑仑5 μmol·L-1)中加入50 μL的小鼠肝微粒体(0.5 g·L-1)，接着加入100 μL NADPH(1 mmol·L-1) 启动反应，37℃孵育15 min。反应结束后，加入2倍体积冰甲醇(含有75 μg·L-1内标卡马西平)终止反应。10 000 r·min-1离心10 min，LC-MS/MS“Cocktail”探针法分析上清液[12]。

1.9NAPQI-GSH结合物测定[13]100 μL 10%组织匀浆+400 μL甲醇沉淀，13 000 r·min-1离心5 min，取上清LC-MS/MS分析。流动相：A：水(0.1%甲酸)，B：乙腈(0.1% 甲酸)；色谱柱：Agilent ZORBAX XDB-C18，3.5 μm，2.1 mm×50 mm Part No. USHP004814；柱温：30℃；流速：0.5 mL·min-1；进样量：10 μL；梯度洗脱(A:0 min→4 min, 98%→2%)，ESI+，MRM模式监测离子对457.1/328.1。

2 结果

2.1APAP对不同妊娠期小鼠肝脏组织病理学的影响如Fig 2所示, 当给予各组小鼠500 mg·kg-1APAP后，未妊娠组小鼠在0、6、24、48 h的肝细胞排列正常，门管区未见炎细胞浸润。妊娠中期小鼠肝小叶在6 h时出现炎细胞浸润；24 h时肝小叶结构模糊, 小叶内肝细胞水肿且胞质淡染；48 h时少量肝细胞排列混乱。妊娠晚期小鼠仅在6 h时观察到肝小叶内有少量炎细胞浸润，其余时间点的小叶内肝细胞基本正常。结果提示，在给予同等剂量的APAP后，妊娠中期小鼠出现了轻微的肝细胞损伤，但在48 h时损伤开始恢复。而未妊娠和妊娠晚期小鼠均未出现明显的肝组织损伤病理学变化。

2.2APAP对不同妊娠期小鼠肝脏转氨酶水平的影响如Fig 3A～3C所示, 当给予各组小鼠500 mg·kg-1APAP后，未妊娠组和妊娠晚期组小鼠在0～48 h内的血清ALT、AST、ALP水平均无明显波动，而妊娠中期组这3个转氨酶水平在6 h时明显升高(P<0.01)，随后在24～48 h内又恢复到正常水平。值得注意的是，妊娠中期组和妊娠晚期组小鼠血清ALP水平的基础值(0 h)均明显低于未妊娠组(P<0.01)。

2.3APAP对不同妊娠期小鼠肝脏组织氧化应激水平的影响如Fig 3D～3F所示, 当给予各组小鼠500 mg·kg-1APAP后，小鼠肝组织MDA水平变化趋势在3组中基本一致：在24 h时明显升高(P<0.01)，在48 h时又恢复到正常水平。SOD水平变化：未妊娠组在0～48 h内有升高趋势；妊娠中期组则是先升高后降低(0～6 h升高，12～48 h降低)；而妊娠晚期组则无明显波动。值得注意的是，妊娠中期和晚期组小鼠血清SOD水平的基础值(0 h)均明显高于未妊娠组(P<0.01)。GSH水平变化：未妊娠组小鼠在0～6 h出现短暂降低后，又于12～48 h内恢复到正常水平；妊娠中期组小鼠则是在0～48 h内持续降低；而妊娠晚期组小鼠在0～48 h内无明显波动。值得注意的是，妊娠中期组小鼠血清GSH水平的基础值(0 h)均明显高于未妊娠组(P<0.01)。

Fig 2 Liver histological evaluation of APAP-treated pregnant mice

Fig 3 Effects of APAP on the serum activity of ALT (A), AST (B), ALP (C) andon liver MDA (D), SOD (E), GSH (F) contents in pregnant n=10)

##P<0.01vs0 h of mid-pregnancy group;**P<0.01vsun-pregnant group

2.4APAP对不同妊娠期小鼠肾脏组织病理学的影响如Fig 4所示, 当给予各组小鼠500 mg·kg-1APAP后，各组小鼠在0～48 h内，肾小球、肾小囊形态结构正常，肾小囊未见沉积物，肾小管未见冠心，上皮细胞未见肿胀变性。上述结果表明，500 mg·kg-1APAP对妊娠各时期小鼠肾脏组织病理无明显影响。

2.5APAP对不同妊娠期小鼠肾脏组织生化和氧化应激指标的影响如Fig 5所示, 当给予各组小鼠500 mg·kg-1APAP后，未妊娠组、妊娠中期组和晚期组小鼠的血清Cre和BUN水平在0～48 h内无明显波动。MDA和SOD水平变化：仅妊娠晚期组在6 h时出现了短暂升高，而后在12～48 h又降低恢复到正常水平；其余组在0～48 h内无明显变化。GSH水平变化：妊娠中期组在0～48 h内有持续降低现象，而其他组未见明显波动。

2.6不同妊娠期小鼠肝脏CYP450s活性的变化如Fig 6A所示，小鼠在妊娠中期(妊娠后10 d)的肝脏CYP1A2、2D6、3A4、2E1酶活性水平明显高于未妊娠小鼠(P<0.01)，而上述代谢酶活性水平在妊娠晚期(妊娠后18 d)，恢复到未妊娠时水平。

APAP的毒性物质基础为其活性代谢产物NAPQI，其稳定性较差，不能被直接检测，但其可被GSH捕获，生成NAPQI-GSH复合物，故研究中常用 NAPQI-GSH水平来反映NAPQI生成量。本研究也对给药后，各组肝脏中的NAPQI-GSH生成量进行了检测。如Fig 6B所示，给予APAP后，各组NAPQI-GSH水平在6 h时均有升高，但仅妊娠中期组存在明显差异(P<0.05)，而在随后的48 h内，NAPQI-GSH在肝脏中水平急剧降低。

3 讨论

妊娠是非常复杂的生理过程，是妇女的一段特殊时期，该时期用药应尤为谨慎。肝脏作为人体最大的代谢器官，含有丰富的药物代谢酶系统，妊娠期激素水平变化影响着肝脏各种代谢或抗氧化酶的水平变化。临床和实验研究表明，妊娠期间CYP450s活性的变化可影响美托洛尔、咖啡因、罗红霉素等药物药代动力学的变化[3]。本研究也证实，妊娠中期肝脏CYP450s主要代谢酶的活性水平上调，这与之前的研究结果相一致[3, 14]。Ning等[15]研究表明，肝细胞核因子4α激活介导了妊娠期小鼠Cyp2d40的表达上调，而其他CYP450s表达上调是否也与该转录因子相关，还有待进一步研究。本研究所观察到的妊娠晚期小鼠肝脏CYP450s活性又趋于正常，这可能跟妊娠期间激素的周期性变化有关，而究竟是哪种激素还有待进一步研究。此外，本研究还发现，妊娠中期和晚期组小鼠血清SOD水平，中期组小鼠的GSH水平均明显高于未妊娠组。该结果提示，在妊娠时期机体自身抗氧化能力增强，可应对突发的自由基水平升高，由于SOD等抗氧化酶表达主要由Nrf2信号通路调控，故妊娠期间的激素水平是否会影响Nrf2信号通路的下游蛋白调控，也有待于进一步研究。

Fig 4 Kindy histological evaluation of APAP-treated pregnant mice

Fig 5 Effects of APAP on the activity ofBUN and Cre in serum, and on theactivity of SOD, the levels of GSHand MDA in kidney tissue of pregnant

Fig 6 The CYP450s activity(A)and the contents of NAPQI-GSH(B)in liver of different pregnant mice

*P<0.05,**P<0.01vsun-pregnant mice

综上所述，本研究表明，500 mg·kg-1APAP可致妊娠中期小鼠产生急性轻微肝损伤，这可能是妊娠中期小鼠肝CYP450s活性升高，以及SOD活性、GSH水平上调共同调节的结果。本研究提示妊娠中期由于CYP450s活性上调，发生经CYP450s介导产生肝毒性的风险上升，临床用药应更关注该时期的用药方案。

(致谢：本实验在西南大学药学院中药药理学实验室完成，感谢给予实验指导、帮助的老师和同学。)