积雪草酸通过激活Nrf2抗氧化通路抑制自发性高血压大鼠心肌纤维化

孟 哲，腾 帅，王 琛，白雪洋，李海禹

(郑州大学第一附属医院心血管内科，河南 郑州 450052)

心肌细胞肥厚、心肌成纤维细胞增殖和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积是心肌纤维化的典型组织学表现，并具有不可逆性[1]。氧化应激能够通过促进脂质、蛋白氧化，破坏细胞膜完整性，延迟细胞内信号传导，诱导心肌细胞凋亡和心肌成纤维细胞增殖等途径，促进心肌纤维化的发展[2]。转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)属于帽和领(Cap’n’Collar，CNC)转录因子家族成员。在氧化应激状态下，激活的Nrf2从细胞质转运至细胞核内，与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合后，上调下游多个抗氧化靶基因表达，包括血红素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶Ⅰ[NAD(P)H︰quinone oxidoreductase 1，NQO1]等[3]。积雪草酸(asiatic acid，AA)是从多年生草本植物积雪草(Centellaasiatica)中提取的五环三萜烯类组分，广泛分布于多种蔬菜和水果中。AA具有抗增殖、抗凋亡、抗炎、抗氧化应激等多种药理学活性[4-5]。AA已被证实能通过上调Nrf2活性，减少氧化产物生成，抑制阿霉素诱导的心脏损害[6]。本研究以自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rats，SHRs)作为压力诱导心肌纤维化模型，观察AA的抗纤维化作用，并试图解释AA 心血管保护作用与其抗氧化应激药理学活性之间的关系。

1 材料与方法

1.1药物与试剂AA(纯度>98%，成都普瑞法生物有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、SOD、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)试剂盒，购自南京建成生物工程有限公司；兔抗大鼠胶原蛋白I(collagen I，Col I)、纤维黏连蛋白(febronectin，FN)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)、血小板活化抑制因子1(plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1)、Nrf2、HO-1、NQO1、p-Akt、磷酸化糖原合酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)、Fyn、β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)；天狼星红染色液试剂盒(北京华越洋生物科技有限公司)。

1.2实验动物8周龄健康♂SHR和Wky大鼠，SPF级，体质量200～230 g，购自中科院上海实验动物中心，动物生产许可证：SCXK(沪)2017-0005。依据处理方式不同，将大鼠分为4组：对照组(Wky)、SHRs组、SHRs+AA组(SHRs+AA 20 mg-1·kg-1·d-1)、AA组(Wky+AA 20 mg-1·kg-1·d-1)，每组10只，连续灌胃12周。所有大鼠均饲养于郑州大学实验动物中心，适应性喂养1周后开始正式实验。饲养条件：温度(25±1)℃，相对湿度(45±5)%，每天光、暗各12 h，自由饮食进水。

1.3大鼠体质量(BW)、收缩压(SBP)、心脏质量/体质量(HW/BW)指数和左心室质量/体质量(LVW/BW)指数测定实验期间，每2周使用电子体重计和鼠尾测压法，测定各组大鼠BW和SBP。实验终末，10%水合氯醛麻醉大鼠，快速取出心脏，生理盐水反复冲洗，滤纸将水分充分吸收。称量心脏质量，小心分离左心室并称重。将心脏质量和左心室质量同体质量相比，计算心脏指数。

1.4大鼠血清SOD、T-AOC活性和MDA含量测定10%水合氯醛麻醉大鼠后，腹主动脉取血5 mL，3 000 r·min-1离心15 min，分离血清后-80℃冷冻保存。严格按照说明书操作流程，进行SOD、T-AOC活性和MDA含量测定。

1.5天狼星红染色4%多聚甲醛固定大鼠左心室组织，石蜡包埋并切片。依据天狼星红染色液试剂盒操作流程，进行天狼星红滴染。偏光显微镜下观察左心室胶原蛋白沉积情况，胶原蛋白染色呈现红色或红棕色。

1.6Westernblot取大鼠心肌组织，使用含有1 mmol·L-1PMSF的RIPA裂解液，在低温环境下进行研磨、充分裂解。核蛋白提取按照核蛋白提取试剂盒说明书操作。4℃、12 000 r·min-1离心15 min，收集组织上清液，使用BCA蛋白含量测定试剂盒进行蛋白含量测定。高温促使蛋白变性后，取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭液封闭。加入一抗Nrf2 (1 ∶400)、NQO1(1 ∶500)、HO-1(1 ∶500)、p-Akt(1 ∶400)、p-GSK-3β(1 ∶400)、Fyn(1 ∶500)、β-actin(1 ∶4 000)和Histone(1 ∶1 000)，4℃孵育过夜，TBST反复冲洗。加入二抗，室温孵育2 h，TBST反复冲洗。ECL化学发光法测定各组蛋白表达情况。

2 结果

2.1AA对SHRs大鼠BW、SBP、HW/BW和LVW/BW指数的影响Tab 1结果显示，各组间体质量无明显差别。同对照组相比，SHRs大鼠SBP、HW/BW 和LVW/BW指数明显升高(P<0.01)。给予SHRs大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干预12周能有效降低SHRs大鼠SBP水平、HW/BW 和LVW/BW指数(P<0.01)。仅给予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干预12周，不影响SBP水平、HW/BW 和LVW/BW指数。

2.2AA对SHRs大鼠心肌组织胶原沉积和ColI、FN、CTGF、PAI-1蛋白表达的影响如Fig 1所示，与对照组相比，SHRs组左心室胶原蛋白沉积水平明显增高。给予SHRs大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干预12周能减少左心室胶原蛋白沉积。West-ern blot结果显示，与对照组相比，SHRs组心肌组织Col I、FN、CTGF、PAI-1蛋白表达明显增加(P<0.01)。给予AA(20 mg-1·kg-1·d-1)处理12周，能降低SHRs大鼠心肌组织Col I、FN、CTGF、PAI-1蛋白表达(P<0.01)。仅给予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干预12周不影响心肌组织胶原沉积和Col I、FN、CTGF、PAI-1蛋白表达。

Fig 1 Effect of AA on collagen deposition (A) and protein expression of Col I,FN,CTGF,and PAI-1 (B) in SHRs

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsSHRs

Tab 1 Effect of AA on SBP,BW,HW/BW and LVW/BW in different )

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsSHRs

2.3AA对SHRs大鼠SOD、T-AOC活性和MDA含量的影响Tab 2结果显示，与对照组相比，SHRs大鼠SOD、T-AOC活性明显降低， MDA含量明显增加(P<0.01)。AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干预12周能提高SHRs大鼠SOD、T-AOC活性，减少MDA含量(P<0.01)。仅给予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)处理12周，不影响SOD、T-AOC活性和MDA含量。

Tab 2 Effect of AA on the levels of SOD,T-AOCand MDA in different

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsSHRs

2.4AA对SHRs大鼠心肌组织Nrf2活性及NQO1、HO-1蛋白表达的影响如Fig 2所示，与对照组相比，SHRs大鼠心肌组织Nrf2核转位水平及NQO1、HO-1蛋白表达明显降低(P<0.01)。AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干预12周能有效逆转压力负荷导致的Nrf2活性降低，以及NQO1、HO-1蛋白合成减少(P<0.01)。仅给予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)处理12周，不影响Nrf2活性及NQO1、HO-1蛋白表达。

2.5AA对SHRs大鼠心肌组织Akt、GSK-3β磷酸化和Fyn核转位的影响有研究表明，Akt/GSK-3β/Fyn信号通路是Nrf2上游重要的调控途径。为了进一步探讨AA的抗纤维化活性和Nrf2抗氧化通路的关系，我们测定了SHRs大鼠心肌组织Akt、GSK-3β磷酸化和Fyn核转位水平。如Fig 3所示，与对照组相比，SHRs大鼠心肌组织Akt、GSK-3β磷酸化水平明显降低，细胞核内Fyn蛋白表达明显增加。AA(20 mg-1·kg-1·d-1)干预12周能明显逆转压力负荷诱导的Akt、GSK-3β磷酸化减少，抑制Fyn核转位增加。仅给予Wky大鼠AA(20 mg-1·kg-1·d-1)处理12周，不影响Akt、GSK-3β磷酸化和Fyn核转位水平。

Fig 2 Effect of AA on Nrf2 activation and protein expression

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsSHRs

3 讨论

心肌纤维化是临床常见心血管疾病共同的病理学表现，它集中体现在ECM过度沉积、心肌细胞病理学凋亡和心肌成纤维细胞异常增殖，进而造成左心室扩张和心功能的明显下降。心肌纤维化具有不可逆性，至今尚无特效药物，成为临床治疗的难题[1]。心肌纤维化发病机制较为复杂，有研究表明，氧化应激与其发病具有密切关系[2]。生理条件下，心肌组织内氧化和抗氧化系统处于相对平衡状态，活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成处于较低水平，满足必要的生理活动。在病理条件下，尤其是压力负荷过重诱导的心肌纤维化过程中，伴随着心肌肥厚和ECM过度沉积，心肌组织处于相对缺氧状态，氧化和抗氧化系统平衡遭到破坏。氧化途径明显激活，而抗氧化能力降低，ROS合成明显增加。进而导致蛋白、脂质分子和核酸异常氧化，诱发信号传导异常，破坏细胞膜的完整性，线粒体功能异常和DNA链断裂，最终引起细胞功能异常、凋亡和坏死，促进纤维化[7]。因此，抑制心肌组织氧化应激反应和减少ROS生成，可能成为逆转心肌纤维化的治疗药物作用靶点。

Fig 3 Effect of AA on phosphorylation of Akt and GSK-3β,andthe nuclear translocation of Fyn in

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsSHRs

伴随着SBP逐渐升高，SHRs心肌组织内胶原蛋白沉积和促纤因子的表达均明显升高。ECM代谢异常，集中体现于胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的生成增多和代谢减少，导致心肌顺应性降低和收缩功能障碍，最终造成心脏形态学和功能学的改变。CTGF和PAI-1通过促进心肌成纤维细胞增殖、胶原蛋白合成增加和抑制金属蛋白酶活性等途径，促进心肌纤维化的发生和发展。已有研究表明，减少CTGF和PAI-1表达，能够一定程度抑制心肌纤维化[8]。AA已被证实能够抑制L-NAME诱导的高血压大鼠主动脉弓部胶原蛋白沉积[9]。本研究发现，AA干预能有效减少Col I、FN、CTGF及PAI-1表达。这预示着AA可能通过影响ECM，尤其是胶原蛋白的代谢和促纤因子的表达，发挥抑制压力负荷诱导的心肌纤维化作用。

SOD是心肌组织内重要的抗氧化酶，能够有效减少ROS生成，清除超氧阴离子，SOD活性水平被认为是评判机体抗氧化能力重要指标。T-AOC可以较为全面地反映心肌组织内抗氧化物质的总体活性，帮助评估心肌组织对ROS清除能力。MDA是细胞膜过氧化的重要产物之一，其含量是反映机体氧化应激水平的一个常用指标[2]。前期研究证实，AA能够有效抑制博来霉素诱导的肺成纤维细胞SOD活性降低和MDA生成增多[10]。我们发现，AA干预能够有效增强SHRs大鼠心肌组织SOD和T-AOC活性，降低MDA含量。结果提示，AA可能通过恢复氧化/抗氧化系统再平衡，增强抗氧化酶活力，减少氧化产物的方式，延缓心肌纤维化进展。

Nrf2激活并与保护性蛋白DNA上游调节区的ARE结合，进而上调下游抗氧化物质表达，是机体最重要的内源性抗氧化信号通路[3]。Nrf2已被证实广泛分布于心脏和血管组织内，同心肌组织抗氧化应激能力密切相关。在发生氧化应激反应时，Nrf2合成增加，同时无活性的Nrf2蛋白与其伴侣蛋白Keap1解离，Nrf2进入活化状态，由细胞质进入细胞核，再与ARE结合，上调抗氧化相关基因HO-1、NQO1的表达，最终起到抗氧化作用。已有研究表明，增强Nrf2抗氧化信号通路活性，能够有效减轻糖尿病心肌损害和缺血诱导的心肌重塑[11]。AA被证明能够通过激活Nrf2，上调HO-1和NQO1表达，减少ROS和MDA生成，减轻阿霉素诱导的心脏和肾脏损害[6]。本研究发现，伴随SHRs心肌组织内氧化应激水平降低，AA干预能够促进Nrf2核转位，上调抗氧化因子HO-1、NQO1表达。结果提示，AA可能通过上调心肌组织抗氧化能力，减少氧化自由基生成，最终抑制心肌纤维化的发展。

有研究表明，伴随GSK-3β磷酸化水平降低，Fyn核转位水平明显提高，进而通过限制Nrf2核内转运，抑制Nrf2对下游抗氧化基因的上调作用[12]。我们发现，在增强Nrf2活性同时，AA能够有效增加SHRs心肌组织内GSK-3β磷酸化，并抑制Fyn核转位。为了进一步探讨AA调控Nrf2的信号机制，我们又观察了Akt的磷酸化水平。作为GSK-3β磷酸化的上游调控分子，Akt磷酸化减少也被证实能够抑制Nrf2核转位[13]。我们发现，AA干预能够明显抑制压力负荷诱导的Akt磷酸化水平降低。以上结果提示，AA可能通过增强Akt、GSK-3β磷酸化，并抑制Fyn核转位，上调纤维化大鼠心肌组织Nrf2活性。

综上所述，AA通过激活Nrf2诱导的内源性抗氧化信号通路，减少SHRs心肌组织氧化应激反应，抑制压力负荷导致的心肌纤维化。同时，AA的Nrf2活化作用，可能与其对Akt/GSK-3β/Fyn信号通路的调节作用相关。

(致谢：本课题在郑州大学第一附属医院重点实验室完成，特别感谢实验的指导老师及各位参与者！)