肺癌转移相关基因ABCE1编码蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域研究

韩旭，于潜，田野，赵希彤，张磊，周镝，田大力

（中国医科大学附属第四医院胸外科，沈阳 110032）

ABCE1基因全称为ATP结合盒E1 （ATP-binding cassette E1） ，又称为RNase L抑制因子［1-2］。近年来报导ABCE1主要参与真核生物蛋白翻译和核糖体回收，HIV-1病毒壳组装［3-6］。ABCE1还与肺癌密切相关，即ABCE1基因是一个参与肺癌转移的相关基因［7-12］。在前期工作中应用GST pulldown方法筛选出ABCE1蛋白的相互作用蛋白β-肌动蛋白，并且应用免疫共沉淀和免疫荧光染色初步证实了ABCE1和β-肌动蛋白的相互作用。ABCE1基因的编码蛋白能够通过与细胞骨架蛋白的相互作用增强肺癌细胞的侵袭迁移能力［13］。本研究在此基础上初步探讨ABCE1基因的编码蛋白和细胞骨架蛋白之间相互作用的结构域。

1 材料与方法

1.1 质粒、细胞与试剂

pGEX-4T-1-ABCE1及pGEX-4T-1-ABCE1-55构建参考文献［14］，A549肺腺癌细胞株 （中国医科大学实验室保存） 、E.coli Competent cells BL21 （DE3）pLysS （中国 Tiangen 公司） 。GST pull-down 试剂盒 （美国 Pierce 公司） 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG；中国 Tiangen 公司） 、Glutathione Sepharose 4B琼脂糖珠 （美国GE公司） 、GST抗兔多克隆抗体 （美国Santa Crus公司） 、蛋白裂解液ProFoundTMLysis Buffer （美国Thermo公司） 、考马斯亮蓝染液R350 （美国GE公司） 、预染蛋白质Marker ［蓝色，（117，85，49，34，25，19） ×103；中国Tiangen公司］。彩虹蛋白预染Marker ［ （170，130，95，72，55，43，34，26，17，10） ×103；美 国Fermentas公 司 ］。GST pull-down试剂盒 （美国Pierce公司） 。洗涤液：0.625% ProFoundTMLysis Buffer （美国Thermo公司） 、10 mmol/L三 （羟甲基） 氨基甲烷醋酸盐，50 mmol/L 醋酸钾，100 mmol/L NaCl，调pH至8.5。洗脱液：10 mmol/L 三 （羟甲基） 氨基甲烷醋酸盐，50 mmol/L醋酸钾，100 mmol/L NaCl，40 mmol/L 谷胱甘肽，调pH至7.4。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒诱导表达及纯化：将测序后重组质粒pGEX-4T-1-ABCE1-55转化大肠杆菌BL21，涂布于LB琼脂平板，37 ℃培养过夜。挑取单菌落若干，制备质粒DNA，经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后鉴定阳性克隆。挑取转化后的单菌落接种到含氨苄霉素的LB培养基中，37 ℃培养过夜后，培养基按1∶50将菌液稀释，37 ℃培养至OD600为0.5～0.6 时，加入终浓度0.4 mmol/L 的IPTG，20 ℃诱导过夜，取5 mL菌液，5 000 g离心5 min收集菌体，加入500 µL裂解液，5µL蛋白酶抑制剂混合物，超声裂解，14 000 g离心10 min，取上清，加125 µL 5×SDS电泳缓冲液，100 ℃加热5 min，冰上放置，取10 µL进行10% SDS-PAGE 电泳。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，脱色后观察电泳结果。400 µL蛋白上清与Glutathione Sepharose 4B琼脂糖珠混合，旋转器10圈/min，4 ℃旋转混合3 h，3 00 µL 洗涤液洗3次，1 000 r/min离心；50 µL 洗脱液孵育10 min，1 000 r/min离心。

1.2.2 GST pull-down实 验 方 法［13］。按 照Pierce公司的GST pull-down试剂盒说明书进行，以GSTABCE1-55 和GST-ABCE1重组蛋白分别与Glutathione- Sepharose 4B结 合 固化，再 与LTEP-a-2细胞株蛋白裂解液孵育，3 00 µL 洗涤液洗3次，1 000 r/min离心；50 µL 洗脱液孵育10 min，1 000 r/min离心。取10 µL进行10% SDS-PAGE 电泳。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，脱色后观察电泳结果。

2 结果

2.1 表达载体pGEX-4T-1-ABCE1-55测序结果

根据测序结果，第55号质粒插入ABCE1基因1 072位的“G”突变为“T” （ 图1） ，形成终止密码子“TGA”，缺失从第358到第600位氨基酸 （图2） 。该质粒会被诱导表达出带有GST标签的含有357个氨基酸的重组蛋白，命名为GST-ABCE1-55，预计蛋白质大小为66×103。

图1 第55号质粒插入ABCE1基因测序结果Fig.1 Gene sequencing results of pGEX-4T-1-ABCE1-55

图2 第55号质粒插入的基因编码氨基酸ABCE1_aa：ABCE1氨基酸序列；55_aa：pGEX-4T-1-ABCE1-55氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence of pGEX-4T-1-ABCE1-55

2.2 GST-ABCE1-55和GST-ABCE1蛋白表达

pGEX-4T-1-ABCE1-55和pGEX-4T-1-ABCE1质粒转化至BL21宿主菌后，与未诱导菌液比较，在预计位置得到新增条带 （图3） 。进一步用抗GST抗体检测诱导的表达蛋白，在预计位置分别诱导菌液中检测到GST-ABCE1-55和 GST- ABCE1表达 （图4） 。

2.3 GST pull-down方法验证GST-ABCE1-55、GST-ABCE1蛋白与β-肌动蛋白的相互作用 （图5）

分别以GST-ABCE1-55和GST-ABCE1重组蛋白为诱饵蛋白，应用GST pull-down技术在肺腺癌LTEP-a-2细胞株蛋白裂解液上清中验证相互作用蛋白，2组经SDS-PAGE电泳并考马斯亮蓝染色后，于GSTABCE1组43×103和55×103之间可见特异条带标记为β-actin，而GST-ABCE1-55组未见特异条带。

图3 GST-ABCE1-55 、GST-ABCE1重组蛋白的表达Fig.3 Protein expression of GST-ABCE1-55 and GST-ABCE1

图4 Western blotting验证重组蛋白表达Fig.4 Expression of GST-ABCE1-55 and GST-ABCE1 protein analyzed by Western blotting

图5 GST pull-down验证GST-ABCE1-55，GST-ABCE1蛋白与β-肌动蛋白的相互作用Fig.5 Interaction between GST-ABCE1-55 and β-actin，GSTABCE1，and β-actin in GST pull-down assay

3 讨论

ABCE1基因位于人类4号染色体4q31上，由1 800个碱基组成，编码1个含600氨基酸的蛋白质，分子量68×103。除了作为RNase L抑制因子、真核生物蛋白翻译和核糖体回收、HIV-1病毒壳组装之外，ABCE1在多种恶性肿瘤中有较高表达［15-23］。

在本课题组的前期研究中，ABCE1基因能够促进肺癌的发生发展，在肺癌的侵袭转移中起到重要作用。通过应用GST pull-down结合质谱分析技术，以GST-ABCE1融合蛋白为诱饵，筛选出ABCE1的相互作用蛋白（β-肌动蛋白）。然后应用免疫共沉淀及共定位分析验证了β-肌动蛋白与ABCE1的相互作用关系，上调ABCE1蛋白使细胞骨架微丝的结构发生重排，进而增强了肺腺癌LTEP-a-2细胞的迁移、侵袭能力［13］。

β-肌动蛋白是微丝的主要成分，是一种中等大小的蛋白质。单体β-肌动蛋白有3个结合位点：1个是ATP结合位点，另外2个都是与肌动蛋白结合的结合蛋白结合位点。肌动蛋白有2种基本形式，球形肌动蛋白单体 （G-actin） 和聚合肌动蛋白微丝 （F-actin） 。大量研究［24-25］证实，真核细胞迁移是由肌动蛋白单体聚合成微丝驱动的。随着微丝成熟，结合在肌动蛋白中央裂隙处的ATP 水解，水解与磷酸的释放不是同步进行的，其中ATP水解速率是磷酸释放的10倍，因此ADP-Pi-F-肌动蛋白是微丝中间的主要形式。磷酸释放后形成ADP-F-肌动蛋白，然后单体从头端解离。解离的ADP-肌动蛋白单体可以进行核苷酸交换，再形成ATP-肌动蛋白单体。可以用于新一轮的聚合。这种由ATP水解驱动的、有方向的微丝生长称为“踏车运动”，进而促进细胞迁移。

根据KARCHER等［26］研究的ABCE1三维衍射模型，ABCE1蛋白有2个核酸结合结构域 （nucleotide binding domain，NBD） ，只编码表达至第357位色氨酸的GST-ABCE1-55蛋白缺失了NBD1结构域和一些富含半胱氨酸的结构域。在本研究中，分别以GSTABCE1-55和GST-ABCE1重组蛋白为诱饵蛋白，应用GST pull-down技术在肺腺癌LTEP-a-2细胞株蛋白裂解液上清中验证相互作用蛋白，结果显示，GSTABCE1-55并没有结合β-肌动蛋白，但是重组表达的GST-ABCE1-55能够结合β-肌动蛋白，说明GSTABCE1-55缺失的第358位至600位氨基酸序列包含能与β-肌动蛋白结合的结构域。影响ABCE1蛋白结构的完整性和立体构象，从而影响与肌动蛋白的结合。

蛋白质之间无时无刻都在进行着相互作用，从而决定一个细胞甚至一个生物体的命运。研究蛋白质相互作用是如何发生的，对于了解生物过程的分子机制，阐明疾病的分子基础，确定潜在的治疗靶点都是至关重要的。本研究首次证实转移相关基因ABCE1表达蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域应该位于第358位至600位的氨基酸编码区，为进一步精确研究ABCE1与细胞骨架蛋白之间的作用机制奠定了基础。