miR-194对人脑胶质瘤U87细胞恶性生物学行为的影响

滕浩，薛一雪，王萍，刘云会

（中国医科大学1.附属盛京医院神经外科，沈阳 110004，2.基础医学院神经生物学教研室，沈阳 110122）

胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，按病理分级可分为Ⅰ～Ⅳ 4个级别。Ⅳ级胶质瘤又称胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM） ，是颅内致死率最高的肿瘤之一，生长呈浸润性，血运丰富，边界不清。目前GBM的主要治疗手段为手术切除，术后同步进行放、化疗。但由于肿瘤高度的侵袭性及增殖能力，预后往往不佳［1］，患者平均生存期也仅有14个月［2］，5年生存率仅5%［3］。研究GBM相关的分子标志物有可能为GBM的诊断、治疗及预后评估提供新的策略。

微小RNA （microRNA，miRNA） 通过与靶基因的3’端非编码区域相结合，能够在转录后水平调节基因的表达。研究显示，miR-194在喉癌［4］、肾透明细胞癌［5］、胃癌［6］、非小细胞肺癌［7］等多种恶性肿瘤中异常表达，但在胶质瘤中的作用尚未见报道。本研究旨在探讨miR-194在不同级别的胶质瘤组织中的表达情况，以及对U87细胞增殖、迁移和侵袭影响，以期为胶质瘤的诊断及治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 胶质瘤组织

23例人脑胶质瘤组织均取于中国医科大学附属盛京医院神经外科，Ⅰ～Ⅱ级7例，Ⅲ～Ⅳ级16例，用于阴性对照的脑组织共5例，来源于脑出血、外伤组织。所有组织离体后立即放入液氮中保存。取材前所有患者均已签署知情同意书，并经过中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂及材料

Trizol试剂 （美国Invitrogen公司）；DMEM高糖培养基 （美国Corning公司）；胎牛血清 （天津灏洋生物科技有限公司）；DMSO （美国Sigma公司）；转染试剂Lipofectamine3000和Opti-MEM®Ⅰ （美国Invitrogen 公司）；TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit （美国Ambion公司）；TaqMan® Universal Master Mix II （美国Ambion公司）；miR-194激动剂miR-194 agomir、拮抗剂miR-194 antagomir （苏州吉玛公司）；CCK-8 Kit（上海东仁化学科技公司）；基质胶Matrigel （美国BD Biosciences 公司）；吉姆萨染液 （北京雷根生物公司）；细胞凋亡试剂盒 （上海东仁化学科技公司） 。

1.3 方法

1.3.1 组织总RNA提取与实时荧光定量PCR：胶质瘤组织4 ℃预冷的PBS清洗后加入1 mL Trizol试剂，吹打数次后移入1.5 mL EP管中，静置5 min后加入0.2 mL氯仿，手动剧烈震荡，室温下静置3 min。将样品放入4 ℃ 离心机中，12 000 g离心15 min，取上层水相至新的EP管中，向样品中加入0.5 mL异丙醇，上下颠倒混匀，室温下静置10 min。4 ℃ 12 000 g离心15 min，弃上清，向样品中加入1 mL 75%乙醇。4 ℃ 7 500 g离心5 min，细胞间干燥10～15 min后加入30～40 µL DEPC水。获取的RNA应用TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit及TaqMan® Universal Master MixⅡ 试剂盒及7500 Fast Real time PCR系统进行实时荧光定量PCR。以U6为内参，以2-ΔΔCt表示mRNA的相对表达量。

1.3.2 U87细胞培养：U87细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM高塘培养液中，于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。每2～3 d传代1次，传代次日更换培养液。取对数生长期、生长状态良好的细胞进行后续实验。

1.3.3 miR-194瞬时转染与分组：使用转染试剂Lipofectamine3000和Opti-MEM®I 将miR-194 激动剂、拮抗剂及阴性对照转染至U87细胞中，并检测转染效率。实验分为5组：空白对照组 （Control） 、转染miR-194 agomir阴性对照组 （pre-NC） 、转染miR-194 agomir实验组 （pre-miR-194） 、转染miR-194 antagomir阴性对照组 （anti-NC） 和转染miR-194 antagomir实验组（anti-miR-194） 。

1.3.4 CCK-8实验检测细胞增殖能力：U87细胞铺于96孔培养板中，每孔大约2 000个细胞，每组细胞铺5个副孔。在37 ℃细胞孵箱中分别培养48 h，加入Cell Counting Kit-8 10 µL后放入37 ℃恒温培养箱中1 h。将96孔板放入酶标仪，选取波长450 nm，测定每孔的光密度（OD）值。

1.3.5 细胞迁移实验：向24孔板内每孔加入600 µL含有10%血清的DMEM高糖培养液，孔内放置孔径为8 µm的Transwell小室。待处理细胞用PBS清洗2次，消化。弃去消化液后加入适量无血清培养液，并吹打成单细胞悬液。细胞计数后取100 µL细胞悬液 （约含10 000个细胞） 均匀地铺在Transwell上室内，放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h。24 h后取出小室，用棉棒将上室内面没有迁移过去的细胞擦净，放入提前配制的固定液中 （甲醇∶冰乙酸 = 3∶1） 固定30 min。用PBS清洗小室后晾干。配制吉姆萨染液（染液∶工作液=1∶9)。将小室倒置，吉姆萨染液滴于小室底面染色1 h。用PBS清洗2次，在倒置显微镜（400×） 下观察细胞的迁移情况，每组随机5个视野，统计细胞个数，以此代表细胞的迁移能力。

1.3.6 细胞侵袭实验：Matrigel基质胶提前融化。取50 µL基质胶（500 ng/µL）均匀地铺在小室内面，放入37 ℃恒温箱中4 h，使基质胶凝固。后续实验方法及统计方法同迁移实验。

1.3.7 细胞凋亡实验：应用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，将细胞轻轻吹打成悬液后转移至1.5 mL离心管中，1 000 r/min离心3 min收集细胞。用PBS继续清洗，1 000 r/min离心3 min，离心后倒掉上清。重复2次。每管加入500 µL Binding Buffer悬浮细胞。每管相继加入5 µL PI和5 µL FITC混匀，室温避光15 min。上机前吹打均匀细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR检测miR-194在胶质瘤组织

及细胞中表达

与对照组脑组织比较，miR-194在胶质瘤组织中的表达量显著降低，并且表达量随胶质瘤组织级别的升高而减少 （P ＜ 0.05，图1A） 。与正常人脑星型胶质细胞比较，miR-194在人脑U87胶质瘤细胞中表达量也显著减少 （P ＜ 0.01，图1B） 。

2.2 miR-194转染效率的检测

图1 miR-194在胶质瘤组织及U87细胞系中的表达Fig.1 mRNA expression of miR-194 in glioma tissues and glioma U87 cells

与对照组比较，pre-NC组及anti-NC组miR-194的表达水平未见明显变化。与pre-NC组比较，pre-miR-194组miR-194的表达水平显著上调 （P ＜ 0.01） ，与anti-NC组比较，anti-miR-194组miR-194的表达水平显著下降 （P ＜ 0.01，图2A） 。

2.3 miR-194对U87细胞增殖能力的影响

与对照组比较，pre-NC组及anti-NC组细胞增殖能力未见明显变化。与pre-NC组比较，pre-miR-194组细胞增殖能力明显下降 （P ＜ 0.01） ，而与anti-NC组比较，anti-miR-194组细胞增殖能力显著增加 （P ＜0.01） 。结果表明miR-194能够抑制胶质瘤细胞的增殖能力 （图2B） 。

2.4 miR-194对U87细胞迁移、侵袭能力的影响

与对照组比较，pre-NC组及anti-NC组细胞迁移及侵袭能力未见明显变化。与pre-NC组比较，premiR-194组细胞迁移及侵袭能力明显下降 （P ＜ 0.01） ，而与anti-NC组比较，anti-miR-194组细胞迁移及侵袭能力显著增加 （P ＜ 0.01） 。结果表明miR-194能够抑制U87胶质瘤细胞迁移及侵袭能力 （图2C） 。

2.5 miR-194对U87胶质瘤细胞凋亡的影响

与对照组比较，pre-NC组及anti-NC组细胞凋亡情况未见明显变化。与pre-NC组比较，pre-miR-194组细胞凋亡率明显增加 （P ＜ 0.01） ，而与anti-NC组比较，anti-miR-194组细胞凋亡率显著下降 （P ＜ 0.01） 。结果显示miR-194能够促进U87胶质瘤细胞的凋亡（图2D） 。

3 讨论

GBM由于其侵袭性生长的特点手术往往难以完整切除，肿瘤极易残余、复发。术后常规行放、化疗虽能一定程度上延缓疾病的进展，但血脑屏障、血肿瘤屏障的存在限制了治疗效果，患者仍然难以获得满意预后［8］。近来大量研究［9-10］显示，基因的异常表达以及基因间异常调控作用与胶质瘤的形成、发展密切相关。

图2 miR-194的转染效率以及对U87细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响Fig.2 Transfection efficiency of miR-194 and the effect of miR-194 on the proliferation，migration，invasion，and apoptosis of U87 cells

miRNA是一类长度18～25个核苷酸的非编码RNA，具有高度保守性，不具备开放阅读框架，通过与靶基因的3’UTR区域相结合，在转录后水平抑制或降解靶基因表达，从而抑制蛋白合成。miRNA在胚胎形成、细胞分化、细胞凋亡、细胞死亡、肿瘤的形成等诸多方面发挥着多元化的调控作用。miR-194是miRNA的成员之一，在大部分肿瘤的生长、分化、迁移、侵袭及凋亡过程中起抑癌作用。在骨肉瘤中，离体及在体实验［11］均证明miR-194能够通过靶向作用于CDH2和IGF1R来抑制细胞的增殖及转移。在结肠癌中，miR-194能够通过调控MAP4K4/c-Jun/MDM2信号途径抑制细胞的增殖能力［12］。在膀胱癌中，miR-194通过抑制RAP2B的表达进而抑制膀胱癌细胞的增殖与侵袭能力［13］。然而，也有报道miR-194在前列腺癌、卵巢癌、胰腺导管腺癌中分别通过作用于SOCS2［14］、PTPN12［15］以及DACH1［16］来促进肿瘤细胞的转移、增殖、克隆形成、迁移及侵袭作用。这可能是基因在不同组织中的差异性作用所致。

本研究应用实时荧光定量PCR分析，证实了miR-194在胶质瘤组织中表达量明显低于对照脑组织，且表达量随胶质瘤级别升高而降低。将miR-194转染至U87细胞后，应用CCK-8法检测细胞增殖能力，结果显示过表达miR-194后U87细胞增殖能力显著下降，而沉默miR-194后细胞增殖能力显著增加。迁移、侵袭实验显示，miR-194过表达后细胞的迁移、侵袭能力显著下降，沉默miR-194后细胞的迁移、侵袭能力明显增加。凋亡实验显示，过表达miR-194后细胞的凋亡率显著增加，而沉默miR-194后细胞凋亡率显著减少。上述研究结果表明miR-194在胶质瘤U87细胞中发挥抑癌的作用，可以作为胶质瘤治疗的靶点之一。

然而，胶质瘤发生与发展机制极其复杂，miR-194是通过何种机制、哪些靶基因发挥的抑癌作用有待于今后进一步研究。