醛固酮诱导p21依赖性肾脏衰老的机制

范愈燕，孙永新，刘青山，周亦伦，李平，梁秉中

（1.首都医科大学附属天坛医院疼痛科，北京 100050； 2.中国医科大学附属第一医院康复科，沈阳 110001； 3.中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100030； 4.首都医科大学附属天坛医院肾内科，北京 100050； 5.中日友好医院临床医学研究所，北京 100029； 6.香港中文大学中医中药研究所，香港 999077）

动物实验和临床研究［1-4］发现，醛固酮在肾脏的生理病理中发挥着非常重要的作用。醛固酮可以诱导大鼠的肾脏的损伤和衰老，可能是通过醛固酮受体和p21依赖的途径所致。血管衰老与载脂蛋白E基因 （apoE-敲除的小鼠） 动脉粥样硬化的进展有关，而p21基因缺失，会减轻衰老和动脉硬化改变［5］，说明p21与血管的衰老密切相关。醛固酮可诱导多种细胞，包括肿瘤细胞［6］、血管平滑肌细胞［7］、肾上皮细胞［8］的p21上调。虽然以往实验［9］已经初步证实p21缺乏可以减少肾皮质衰老，但醛固酮是否通过p21调节肾脏的衰老而加速了肾脏的损害机制，仍需要进一步明确。因此本研究探讨了醛固酮诱导肾脏衰老和损害的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：采用人近端肾小管上皮细胞的永生系细胞株ImHPTCs，该细胞由AKRIA NISHIYAMA 香川大学赠予，保持HPTCs基本生物学特性。

1.1.2 实验动物：4周龄的p21（-/-）小鼠和 （FVB） 野生型小鼠均由维通利华公司配殖提供。

1.1.3 主要试剂：RPMI-1640 培养液 （美国Quality Biological公司）；胎牛血清FBS （美国Gibico公司）；siRNAs 的靶基因p21 and MR （美国Santa Cruz公司）；N-acetyl L-cysteine （美国 MedChem Express 公司）；β-Gal （pH6.0） ，染色液 （1 mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷，5 mmol/L亚铁氰化钾，150 mmol/L氯，2 mmol/L 氯化镁，0.01% 脱氧胆酸钠，0.02%-40 Nonidet）；p21 （美国BioSource International公司） ，MR （美国Santa Cruz公司）；脂质体2000 （美国Invitrogen公司）；5’-Bromo-2’-deoxyuridine （美国Sigma公司） 。

1.2 方法

1.2.1 模型制作、分组和给药方法：模型制作见参考文献［1］和［4］。小鼠体质量50 g，给予戊巴比妥钠（20 mg/kg，IP） 麻醉，1%NaCl饮水，随机分为以下2组：（1）对照组，FVB小鼠［n = 10，2%乙醇 + 醛固酮 0.6 g / （kg·d）］；（2）实验组，p21（-/-）小鼠组［n = 10，2%乙醇 + 醛固酮 0.6 g/ （kg·d） ］。其中醛固酮和乙醇均采用皮下渗透微泵 （北京拜安吉科技有限公司） 置于肩胛间皮下泵入，每2周在麻醉下更换渗透微泵，每只小鼠共应用3个渗透微泵，实验时间为5周。

1.2.2 细胞培养：温度敏感SV40的含腺病毒LTAn抗原永生化人的近曲小管细胞ImHPTCs细胞珠生长在Click’s Medium培养基中 ［（RPMI-1640 1∶1 （美国Quality Biological公司） ，含1% insulin- transferrin-selenium，40 ng/mL地塞米松，10 ng/mL表皮生长因子，2%胎牛血清 （FBS） ，2%青霉素，链霉素］，在33 ℃，5%CO2完全饱和湿度条件下培养。

1.2.3 β-Gal染色：6孔板内细胞给予药物刺激后2 h，用PBS冲洗2次，在37 ℃新配置的1 mg/mL β-Gal（pH6.0） 染色液中培养并染色，染色后于100倍的显微镜下观察衰老的细胞［8］。室温下2%甲醛/0.2%戊二醛中固定肾脏组织3～5 min，用PBS冲洗2次，在37℃新配置的1 mg/mL β-Gal （pH6.0） 染色液中培养并染色。染色后，将组织固定在OCT 中冷冻保存。在低温下将冷冻组织切为5～6 mm的薄片，进行PAS染色。在100倍的显微镜下进行衰老细胞计数，在每张载玻片中随机选择5个领域，计数胞质中有蓝色沉淀的细胞百分数。

1.2.4 实时 PCR：通过实时PCR方法检测细胞中β-actin、p21、肿瘤坏死因子 （tumor necrosis factor α，TNF-α）、胶原蛋白Ⅰ型和Ⅲ型 （collagenⅠ和 collagenⅢ） mRNA的表达。提取细胞总RNA，进行反转录合成cDNA，利用SYBR GreenⅠ试剂盒 （美国Applied Biosystems公司） 行实时PCR，然后应用ABIPrism 7000序列检测系统 （美国Applied Biosystems公司）测序，各引物序列见表1。以β-actin作为内参照，分别计算每个靶基因与β-actin的比值。

表1 基因扩增引物序列Tab.1 Oligonucleotide primer sets used for gene amplification

1.2.5 RNA 干扰：将p21和MR的小RNA通过脂质体2000 转染到靶细胞。当细胞达30%～50%的亚融合状态，在无抗菌素存在的条件下，向6孔的培养皿每孔中加入无血清的RPMI-1640培养液（含3.5的脂质体2000和100 pmoL siRNA），培养8 h后再更换为原培养液。

1.3 统计学分析

应用SPSS 10.0统计软件对数据进行统计分析。实验数据以表示，计量资料组间比较采用ANOVA方差分析通过Bonferroni’s test，半定量资料组间数据比较采用秩和检验。P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 醛固酮诱导人肾脏近曲小管细胞的衰老变化

醛固酮诱导使TSImHPTCs的β-Gal活性明显升高，而升高的活性没有受到对照组的争夺载体转染影响，而是被p21和MR的siRNA明显抑制。通过这些离体实验的数据证明，醛固酮可能是通过MR/p21依赖的途径诱导了肾脏细胞衰老，见图1A。

2.2 细胞衰老对细胞纤维化基因表达的影响

图1 醛固酮诱导肾脏近曲小管细胞的衰老变化Fig.1 Changes in the expression of aldosterone-induced renal senescence genes in immortalized human proximal tubular cells

评估细胞衰老在细胞凋亡和纤维化的分子表达的作用，结果发现 10 nmol/L浓度醛固酮使TSIm-HPTCs TNF-α、Ⅰ和Ⅲ型胶原的基因表达显著增加（图1B～D） ，这些变化被p21基因siRNA的转染所抑制，表明细胞衰老参与肾脏的损伤过程与p21通路有关。

2.3 醛固酮诱导p21 （-/-） 小鼠肾内β-Gal活性变化

采用醛固酮诱导正常的FBV小鼠和p21（-/-）小鼠，观察肾脏组织的衰老变化。发现醛固酮有效地诱导了正常FBV小鼠肾脏组织β-Gal活性 （图2A） 的增加，在近曲小管细胞尤为显著；而p21（-/-）小鼠肾小球的β-Gal染色面积，即活性表达明显减少。进一步证明醛固酮诱导了p21依赖性、非高血压依赖性的肾组织衰老机制。

2.4 醛固酮诱导p21 （-/-） 小鼠肾内纤维化基因的表达

采用醛固酮诱导正常的FBV小鼠和p21（-/-）小鼠，观察肾脏组织纤维化的变化。 醛固酮显著诱导了正常FBV小鼠肾脏组织的TNF-α、Ⅰ和Ⅲ型胶原的基因表达 （图2B、C） ，而醛固酮诱导的p21（-/-）小鼠肾脏组织的纤维化却明显减轻，说明醛固酮诱导的大鼠肾脏损害是通过p21通路实现的。

3 讨论

醛固酮是一种重要的调节电解质平衡的激素。之前的实验［1，5］也证明，醛固酮可诱导肾小球硬化和肾小管间质纤维化，与肾组织的衰老密切相关，特别是肾小管上皮细胞，其损伤性可能是通过MR/超氧化物/p21依赖/非血压依赖的途径进行调控。本研究采用体外p21转基因小鼠和体内细胞实验进一步验证醛固酮诱导肾脏衰老的p21依赖性机制。

众所周知，当细胞暴露在压力状态下，可通过多种途径保护其分化［11-12］。作为一种外在的压力，醛固酮在改变细胞凋亡的命运、上皮间质转化或衰老中的作用机制目前尚不清楚。本研究发现，醛固酮可以诱导细胞衰老和增加TNF-α和胶原蛋白表达，这个结果与以前的文献报道［13］一致，说明醛固酮可增强自分泌/旁分泌的凋亡/炎症和纤维化信号表达。重要的是，这些增加的信号会因p21基因的敲除而减少，这表明醛固酮诱导的TNF-α和胶原蛋白表达的变化可能是p21依赖性细胞衰老。醛固酮、细胞衰老和凋亡之间详细的关系需要进一步研究。

图2 醛固酮诱导p21 （-/-） 小鼠肾内β-Gal活性变化及肾脏皮质纤维化改变Fig.2 Changes in β-Gal activity and in collagen I and collagen III mRNA levels in aldosterone-induced p21 （-/-） mice

临床研究［14-15］表明，老年人捐助肾脏进行移植的生存率低，且在肾脏移植的肾病患者中p21表达增加［16］。这样的证据可能反映了一种假说，即衰老的肾脏更容易感受各种疾病，特别是肾小管功能更易于受到影响，如急性肾损伤和慢性肾病进展性尿蛋白，原因是肾小管修复活动减少［17-21］。因此，为了进一步证明这个假说，本研究采用p21（-/-）小鼠和正常FBV小鼠，分别泵入醛固酮，观察肾脏皮质中β-Gal、胶原蛋白表达情况，结果发现，正常FBV小鼠的肾脏皮质在醛固酮的诱导下，β-Gal和胶原蛋白基因表达显著增加，而p21（-/-）小鼠肾脏皮质中则表达减弱。因此，进一步证明了醛固酮诱导胶原蛋白表达的变化可能是p21依赖的细胞衰老的假说。

总之，醛固酮诱导肾小管上皮细胞β-Gal高表达，表明肾小管是醛固酮诱导肾功能衰老的靶器官，慢性醛固酮的暴露可能导致p21依赖性肾功能不全的发生和发展。在目前的临床研究中尚未提及的一个重要的问题为醛固酮增多症患者是否出现肾脏衰老变化，这些变化是否可以被MR阻断剂的药理作用所治疗或预防，这个问题有待进一步研究解决。