缺血后处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12的影响

刘鸿涛

(深圳市龙华区中心医院 广东医科大学附属龙华中心医院心血管内科，广东 深圳 518110)

急性心肌梗死是目前世界范围内致病及致死的最主要原因之一。然而“缺血再灌注损伤”亦会对心肌造成损害。因此如何在心肌再灌注时对心脏进行较好地保护是当前的研究热点，例如局部的缺血后处理，而通过再灌注开始时的多次短暂的缺血再灌注被证实具有一定的心肌保护作用〔1〕。临床及动物实验报道显示可通过多种干预方式对心肌进行保护，但具体的有效机制尚不十分明确〔2〕。内质网在机体的钙离子稳态、脂质生物合成及蛋白质折叠中发挥着重要作用，心肌发生缺血时常伴随内质网的应激反应，内质网的应激反应是细胞生存的一种自身的保护反应，同时也可诱导细胞的凋亡〔3〕。蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)、肌醇必需酶(IRE)1和激活转录因子(ATF)6是内质网的触发因子，内质网被触发后将释放出葡萄糖调节蛋白(GRP)78，而GRP78被认为是内质网应激的主要标志物之一〔4〕。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-12是半胱氨酸蛋白酶家族成员之一，目前研究显示内质网应激能够将其激活，然后进入细胞液激活其他的caspase家族成员，最终完成细胞的凋亡〔5,6〕。本研究建立大鼠心肌缺血再灌注损伤动物模型，分析其在缺血后处理对内质网应激损伤相关蛋白GRP78及caspase-12表达的影响。

1 材料与方法

1.1动物分组 选取雄性Wistar大鼠30只，购自广东省实验动物监测所，体重250～300 g，平均(276.3±15.4)g,将大鼠编号为1～30号，通过随机数字表将其均分为A组(空白对照组)、B组(心肌缺血再灌注损伤组)、C组(心肌缺血后处理组)，每组10只。本研究操作及相关内容均经医院伦理委员会批准。

1.2手术操作 所有动物经腹腔注射戊巴比妥(60 mg/kg)麻醉，随后使用16号管予以插管，同时采用小型动物呼吸机(SAR-830 A/P,CWE)给予辅助通气；操作过程中实时监测大鼠的体温，使大鼠体温保持在36～38℃，通过中部胸骨打开胸廓，去除心包后暴露心脏，将单根7号缝线置于左冠状动脉的近端，A组大鼠操作至此结束，旷置3 h。B、C组大鼠则进行结扎45 min，覆盖一小块纱布防止动脉损伤，通过观察心肌的颜色改变和局部的运动障碍对心肌的缺血进行确认。诱导性缺血结束后取出结扎，使B组大鼠心肌组织再灌注2 h；C组大鼠则给予3个循环的10 s缺血及10 s再灌注的缺血后处理操作，之后再灌注2 h。

1.3指标分析

1.3.1心肌梗死面积的检测 在2 h再灌注结束后，对所有大鼠进行安乐死处理后取出心脏，使用1%的Evans蓝进行逆行灌注显示出危险区域(AAR)，然后将心脏自顶端进行组织切片，并在室温下1%磷酸盐缓冲的2,3,5-三苯基四唑氯化物溶液(TTC)中孵育，以显示出梗死的心肌组织，后将切片置于10%甲醛中进行固定，使用Image J软件定量分析梗死面积。缺血面积百分比=AAR/总心室面积×100%，梗死面积百分比=梗死区域面积/缺血区域面积×100%。

1.3.2内质网应激相关蛋白的免疫印迹分析 对AAR区域的心肌组织进行Western印迹分析，A组则取类似部位心肌组织进行检测，将-80℃液氮内冷冻的心肌组织粉碎后提取蛋白质，根据产品的使用说明书通过Bio-Rad DC蛋白测定试剂盒(Calif)检测蛋白浓度，后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离并转移至硝酸纤维素膜上，将膜在4℃与一抗孵育过夜，一抗为抗GRP78山羊抗体(1∶1 000，Santa Cruz)，抗caspase-12小鼠抗体(1∶500，IMGENEX)，GAPDH(小鼠抗体;Sigma-Aldrich)用作对照，二抗为抗山羊辣根过氧化物酶(1∶5 000)及抗鼠免疫球蛋白(1∶5 000)，使用Lumino-image分析仪(Fujifilm)显示条带的吸光度值。

1.3.3各组大鼠的神经行为学分析 依据现有的文献在处死大鼠之前对其神经行为学进行评估〔7,8〕，内容包括：(1)整体的神经损害评分：0分为无神经损害，1分为对侧前肢屈曲及肩关节内收，2分为对外侧推力的抵抗降低，3分为同侧的旋转运动；(2)旋转实验：使用20 r/min木条，记录大鼠5 min内从开始转圈至掉落的时间；(3)悬吊实验：45 cm高的铁丝，记录大鼠从开始悬吊至掉落时的时间；(4)平衡木行走实验：平衡木长度60 cm，宽度5.1 cm，高度50 cm，记录大鼠通过的时间。

1.4统计学方法 应用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1三组大鼠心肌梗死面积比较 A组心肌切片经Evans蓝与TTC染色处理后均呈现蓝色，表明无缺血及梗死区域，B组与C组心肌组织切片可见红色的缺血区域及白色的梗死病灶区域，宏观上看B组缺血及梗死病灶面积大于C组。经Image J软件量化分析后显示，与组织切片相一致的结果，即C组心肌组织的缺血面积百分比〔(41.22±8.86)%〕及梗死面积百分比〔(30.19±7.74%〕均显著低于B组〔(56.25±10.24)%、(39.67±8.54)%;t=3.510、2.601，P=0.003、0.018〕。见图1。

图1 三组大鼠心肌切片染色结果

2.2三组大鼠心肌组织的Western印迹分析 A组大鼠的相应部位心肌组织的GRP78及caspase-12蛋白表达均低于B组及C组(P<0.05)；C组大鼠的caspase-12蛋白表达低于B组，而GRP78蛋白表达高于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1，图2。

表1 三组大鼠心肌组织中GRP78及caspase-12蛋白表达比较

与A组比较：1)P<0.05;与B组比较：2)P<0.05

图2 三组大鼠Western印迹分析条带

2.3三组大鼠神经行为学比较 三组大鼠的神经损害程度、旋转实验、悬吊实验以及完成平衡木行走实验的各项数值之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 三组大鼠神经行为学评估比较

3 讨 论

心肌缺血后的再灌注是缓解患者临床症状及预防缺血进一步恶化的最有效手段，但同时伴随着再灌注损伤，表现为心肌细胞的凋亡及梗死病灶的扩大化〔9〕。心肌缺血后处理的积极作用最初由2003年一项国外的研究通过狗心肌缺血再灌注损伤发现，后于临床实践中选择ST段抬高的急性心肌梗死患者为研究对象，经急诊冠状动脉血管成形术后给予缺血后处理能够显著降低心肌的梗死病灶区域面积。本研究中通过大鼠的急性心肌缺血模型亦得到类似的结果，缺血后处理操作相对于单纯的缺血再灌注能够著减少心肌的缺血及梗死面积。

内质网的应激反应由于涉及机体的多种生理及病理过程从而发挥着重要的影响。有研究报道称，内质网的应激反应在多种细胞和组织内同时具有利弊作用，主要取决于细胞生存与凋亡间的平衡〔10〕。一项研究显示，GRP78在肿瘤、脑组织及心肌缺血再灌注内发挥着重要的细胞保护作用〔11〕；体外研究中缺血再灌注之前使用药物激活GRP78能够显著减少心肌细胞的凋亡，缺血前通过二氧化硫的预处理亦能够减小大鼠缺血心肌的梗死面积，目前认为这些缺血预处理引起的心脏保护作用与GRP78的表达增加相关，转染GRP78的反义寡核苷酸能够逆转这种保护作用。这与本研究的结果相一致，缺血后处理大鼠的GRP78蛋白表达量显著高于单纯再灌注损伤的大鼠模型，组织病理学同样证实缺血后处理对减少心肌细胞凋亡相关的心肌保护作用。但有部分研究报道缺血再灌注2 h后缺血后处理能够降低内质网的应激反应，主要表现为钙网织蛋白的降低〔12〕，因此有必要综合多种内质网应激的相关标志物及多个采集时间点以进一步加以证实。

人体内细胞的凋亡和炎症反应等与caspase家族具有密切关联，有研究证实，caspase-12能够在内质网应激反应时激活，然后进一步调节细胞凋亡通路从而诱导细胞凋亡〔13〕。多种外界的物理、化学、放射、缺氧等刺激均可引起细胞内发生内质网的应激，最终的凋亡均与caspase-12相关〔14〕。本研究结果显示单纯的心肌缺血再灌注能够使心肌细胞内caspase-12表达增加，宏观上显示心肌的缺血及梗死病灶增加，而缺血后的处理操作能够使其表达降低，从而减少心肌细胞的凋亡，缺血及梗死面积减少。

另外，本研究存在一定的局限性，首先表现在纳入研究的动物数量较少，同时未纳入所有的内质网应激相关的主要标记物及凋亡相关的其他通路蛋白，未对再灌注后的检测时间点进行细化分析，因此获得的结论力度欠佳，但本研究的结果初步证实对于大鼠的心肌缺血再灌注损伤模型，缺血后的处理能够一定程度上减少心肌缺血及梗死的面积。其作用与内质网的应激反应增加相关，表现为GRP78标志物的表达增加，并且这种应激能够通过抑制凋亡通路降低心肌细胞的凋亡，从而对缺血心肌产生保护作用，改善患者心功能和生存预后。神经行为学评估结果显示心肌的缺血再灌注损害并未对大鼠的神经行为学产生显著影响，可能与缺血再灌注的时间较短相关。