蛋白尿为主要表现的肾损伤患者肾小球TRPC6和ILK的表达及作用机制

陈晓玲 彭 毅

(石河子大学医学院第一附属医院心内科，新疆 石河子 832000)

肾小球滤过屏障结构和生理功能异常引发的蛋白尿是肾损伤患者的主要临床特征，而足细胞结构中的裂孔隔膜和足突是肾小球滤过屏障的主要成分〔1〕。足细胞正常结构的破坏是多种原发或继发肾脏疾病蛋白尿发生与发展的主要因素〔2〕；因此，修复并维持足细胞的正常结构和功能是肾脏疾病治疗的关键。相关研究显示，足细胞中瞬时受体电位阳离子通道(TRPC)6及其介导的上、下游信号通路与蛋白尿相关〔3〕。整合素连接激酶(ILK)是足细胞中肌动蛋白与整合蛋白相互连接的骨架，可能参与调控肾小球滤过屏障功能〔4〕。本实验观察以蛋白尿为主要表现的肾损伤患者肾小球中TRPC6、ILK表达和分布情况，并通过体外细胞实验进一步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1肾组织收集 收集2016年1月至2017年6月间在石河子大学医学院第一附属医院行肾脏穿刺活检且24 h尿蛋白>1 g的患者肾组织标本共25例。选取同期因肿瘤、外伤等原因切除的肾组织标本为对照组10例，均无蛋白尿。上述标本均经甲醛固定，脱水、透明、石蜡包埋，3 μm连续切片，分别行苏木素-伊红(HE)和免疫组化染色。

1.2主要材料与试剂 人原代肾足细胞购于上海晶抗生物工程有限公司；胎牛血清、DMEM细胞培养基、重组γ干扰素购于江苏恩莫阿赛生物技术有限公司；兔抗人TRPC6多克隆抗体和ILK多克隆抗体购于上海信裕生物科技有限公司；脂质体2000、pcDNA3.1-TRPC6质粒购于上海依赫生物科技有限公司。

1.3免疫组化染色 高温修复抗原，灭活过氧化物酶，羊血清封闭肾组织标本；滴加1∶500倍稀释的TRPC6、ILK抗体，4℃孵育过夜，剩余步骤按试剂盒说明进行；磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照，试剂盒公司提供阳性对照。光学显微镜下观察细胞质中存在黄褐色颗粒为阳性，依据阳性细胞染色情况进行半定量分析。

1.4人原代肾足细胞培养与转染 用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基培养人原代肾足细胞。向培养基中滴加10 U/ml的重组γ干扰素，33℃ 5%CO2培养箱中孵育，观察细胞增殖面积占培养皿表面50%以上时，将细胞放于37℃ 5%CO2培养箱中，使用DMEM完全培养基孵育8～12 d。用10-7mol/L的阿霉素诱导成熟的人原代肾足细胞12、24、36 h。通过脂质体2000将pcDNA3.1-TRPC6质粒、pcDNA3.1分别转入人原代肾足细胞建立TRPC6过表达组、阴性对照组，以仅加脂质体2000的为空白对照组，转染48 h后用于后续实验。

1.5Western印迹检测TRPC6、ILK蛋白表达 蛋白质提取试剂盒提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定浓度。取80 μg蛋白行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，电转膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉室温下封闭非特异性抗原2 h，滴加兔抗人TRPC6多克隆抗体(1∶500)、兔抗人ILK多克隆抗体(1∶500)，选用兔源性β-actin多克隆抗体(1∶1 000)为内参，4℃孵育过夜；洗膜后滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室温下反应1 h。电化学发光(ECL)显色，凝胶成像系统读取目标条带灰度值。

1.6统计学分析 采用SPSS22.0软件行t检验。

2 结 果

2.1肾组织中TRPC6和ILK表达情况 TRPC6和ILK在正常肾组织和各类慢性肾病的肾小球中均有表达。TRPC6多表达于足细胞中，ILK除足细胞外也在系膜区表达。在膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化症、狼疮性肾炎、紫癜性肾炎、IgA肾病、糖尿病肾病的肾小球中TRPC6表达强度均明显高于正常肾组织(P<0.05)；在高血压肾损伤组织中，TRPC6表达强度与正常肾组织之间差异无统计学意义(P>0.05)。局灶节段性肾小球硬化症、狼疮性肾炎、糖尿病肾病的肾小球中ILK表达强度均明显高于正常肾组织(P<0.05)。见图1、图2。

图1 正常肾组织和各类型肾脏损伤组织中TRPC6表达(免疫组化染色，×400)

图2 正常肾组织和各类型肾脏损伤组织中ILK表达(免疫组化染色，×400)

2.2阿霉素损伤人原代肾足细胞后TRPC6、ILK蛋白表达情况 正常对照组TRPC6蛋白相对表达量为0.35±0.08；阿霉素组诱导12、24、36 h，TRPC6蛋白相对表达量分别为0.41±0.09、0.68±0.12、0.79±0.15。正常对照组ILK蛋白相对表达量为0.51±0.09；阿霉素组诱导12、24、36 h，ILK蛋白相对表达量分别为0.65±0.13、0.79±0.16、1.16±0.23。10-7mol/L的阿霉素诱导24、36 h时TRPC6、ILK蛋白表达水平均明显高于正常对照组(P<0.05)。见图3。

图3 阿霉素损伤足细胞后TRPC6、ILK蛋白表达(Western印迹)

2.3人原代肾足细胞过表达TRPC6后对ILK蛋白表达的影响 转染48 h后TRPC6过表达组人原代肾足细胞TRPC6蛋白相对表达量为0.71±0.25，明显高于阴性对照组和空白对照组的0.45±0.13、0.38±0.09(P<0.05)；TRPC6过表达组ILK蛋白相对表达量为0.85±0.17，明显高于阴性对照组和空白对照组的0.60±0.11、0.55±0.13(P<0.05)；阴性对照组和空白对照组TRPC6、ILK蛋白相对表达量之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图4 足细胞过表达TRPC6后ILK的蛋白表达(Western印迹)

3 讨 论

TRPC6属于瞬时受体电位超家族成员，参与调控足细胞传导通路以及维持细胞结构。当其发生突变后可引发肾病综合征、蛋白尿，病理提示为局灶节段性肾小球硬化性改变。相关研究显示，在膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化症、微小病变性肾病等肾小球疾病中均可检测出TRPC6表达上调，且上述疾病临床症状均以蛋白尿为主〔5〕。研究已发现TRPC6可损伤足细胞，进而在蛋白尿和肾小球病变中发挥重要作用〔6〕。正常状态下足细胞TRPC6的活性很低，经转染修饰或物理增压后可明显提升其活性。本实验结果显示，除高血压肾损伤外，其他类型肾损伤组织(膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化症等)肾小球中TRPC6表达水平较正常肾组织明显提升，且在光学显微镜下表现为足突不同程度融合，提示TRPC6异常表达与足细胞损伤引发的蛋白尿有关。

ILK为丝氨酸/苏氨酸激酶，通过多种信号传导通路参与细胞增殖、迁移等过程。当其表达上调后可引发足细胞突变，引发蛋白尿。在肾小球疾病、糖尿病肾病等多种蛋白尿性肾病动物模型中均存在ILK异常表达，抑制ILK表达可有效改善蛋白尿症状。使用基因敲除技术处理ILK基因后，小鼠足细胞生理功能和结构完整性被破坏〔7〕。上述研究提示ILK可参与肾小球屏障功能调控，但目前ILK表达很少在肾组织活检中被提及。本实验显示，TRPC6、ILK在肾小球中表达部位均位于足细胞，在局灶节段性肾小球硬化症和糖尿病肾病这两种发病率较高的足细胞肾病中，ILK表达水平与TRPC6呈正相关，提示TRPC6、ILK可能共同参与足细胞肾病的发生、发展，但二者之间的关联仍不明确。