苗药飞龙掌血抗大鼠急性痛风性关节炎的作用

田培燕 余跃生 邓祖国 陈应康 祝 星

(黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000)

飞龙掌血是芸香科飞龙掌血属(Toddalia)植物飞龙掌血的根或根皮，全年可采挖。飞龙掌血最早收载于《植物名实图考》，味苦，性冷，具有消肿解毒，祛风除湿的功效。在我国主要分布在贵州、云南和四川等西南省份，是典型的苗族药物〔1，2〕。苗族民间将飞龙掌血的根或根皮的水煎液或药酒治疗跌打损伤和风湿性关节炎，动物研究也显示飞龙掌血具有明显的镇痛抗炎活性〔3，4〕。急性痛风性关节炎(AGA)的临床症状在于关节处红、肿、热和痛，严重者可致关节变形，临床常用糖皮质激素或秋水仙碱缓解其症状，但这两类药物容易引发严重不良反应，甚至导致炎症复发〔5〕。本文探讨飞龙掌血对鼠AGA治疗作用及可能机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 SPF级大鼠80只，体质量180～220 g，雌雄各半，购于重庆腾鑫生物技术有限公司，合格证号：SCXK(瑜)〔2007-0006〕。

1.2受试药 飞龙掌血购于遵义市中药材批发市场。由黔南民族医专魏学军教授鉴定为飞龙掌血干燥根。取干燥至恒重的飞龙掌血药材1 kg，采用70%乙醇溶液进行提取，回流提取2次，每次溶剂的体积为所用药材的12、10倍，分别提取2、1 h，合并2次提取液，减压过滤。秋水仙碱(云南省玉溪望子隆生物制药有限公司，国药准字：H53021904，规格：0.5 mg/片)。

1.3仪器与试剂 N4紫外可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)；DB027型鼠尾光照测痛仪(北京智鼠多宝生物科技有限责任公司)。尿酸晶体(美国Sigma公司)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒均购自贵州明涵生物科技有限公司。

1.4制备AGA大鼠模型 将大鼠固定于自制大鼠架上，暴露右侧踝关节，依次采用碘伏及医用酒精消毒皮肤表面，以45°在大鼠右侧踝关节背侧插至胫跗关节腔，缓慢注射(5%)尿酸钠0.1 ml。

1.5分组和给药 将AGA大鼠随机分为5个组：模型组、秋水仙碱组(0.3 mg/kg)、飞龙掌血低、中、高剂量组(1、2、4 g/kg)，将正常大鼠同样部位注射0.9%氯化钠注射液0.1 ml为对照组，所有组别灌胃给药，对照和模型组给予生理盐水，给药体积20 ml/kg，1次/d，10只/组，连续给药10 d。

1.6步态评分 给药1、5、10 d对步态进行评分：0分：行走正常；2分：轻微跛行，右下肢微弯；4分：中度跛行，右下肢刚可触地面，6分：重度跛行，仅能3足行走，右下肢难以触及地面。分数越高，步态越差。

1.7足趾肿胀体积 给药1、5、10 d测量大鼠踝关节体积，采用自制足趾肿胀体积装置测量大鼠右后肢踝关节体积。

1.8痛阈 给药1、5、10 d记录动物痛阈。在20℃环境下，固定大鼠，采用鼠尾光照测痛仪，使大鼠双后肢暴露在灯下，双后肢距灯约3 cm，记录自照射至大鼠缩腿反应的时间。

1.9外周血炎症因子 给药结束后2 h，断尾法取血，离心得血清，采用酶联免疫吸附检测(ELISA)，严格按照试剂盒说明检测血清的IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.10逆转录聚合酶链反应检测关节滑膜组织NF-κBp6表达 给药结束，处死大鼠，切开大鼠膝关节前侧髌前韧带髌骨下缘，分离髌下脂肪垫，得到关节滑膜，用10%甲醛溶液固定48 h，制作病理切片，行免疫组化染色。

1.11关节滑膜组织中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达 RNA提取 于10 d给药后2.5 h，处死大鼠，游离大鼠右后肢关节滑膜组织，称取50 mg，液氮研磨，加1 ml TRIzol 匀浆，离心去除未裂解组织。加0.2 ml氯仿，振荡均匀，离心取上清。加0.5 ml 异丙醇，离心去上清。加1 ml 75%乙醇，离心去上清，干燥得RNA。加 25 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水，-80℃备用。PCR反应在EP管中，加入3 μg总RNA、1 μl 10 μmol/L Oligo，以DEPC水补至 12 μl。PCR仪上65℃加热5 min，冰浴3 min。在EP管加4.0 μl 5×反应缓冲液、2 μl 10 mmol/L dNTP混合物、1 μl反式TM M-Mu LV反渗透液和1 μl RNA酶抑制剂，70℃ 5 min，得cDNA。取1 μl cDNA为荧光定量模板，反应体系：5 μl 2×核酸染料，1 μl 10 μmol/L正向引物，1 μl模板DNA，1 μl 10 μmol/L反向引物和2 μl无RNA酶水。95℃ 5 min，95℃10 s，60℃ 30 s，40个循环，GAPDH为内参。IL-1β、IL-6和TNF-α序列见表1。

表1 IL-1β、IL-6和TNF-α的序列

1.12大鼠关节滑膜组织 NF-κBp65 的表达于10 d给药后，取患肢的滑膜组织，并制成石蜡切片，滴加正常山羊血清封闭液，滴加Ι抗 PBS 50 μl/片，4℃过夜，在 37℃复温10 min，PBS洗涤，滴加Ⅱ抗PBS 50 μl/片，37℃ 30 min，PBS洗涤，二氨基联苯胺(DAB)显色，镜下查看。

1.13统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行F、t检验。

2 结 果

2.1各组步态评分比较 与对照组比较，造模后1、5、10 d模型组步态评分明显增高(P<0.05)；与模型组比较，飞龙掌血各组及秋水仙碱组步态评分均有不同程度降低(P<0.05)，呈时间-剂量依赖性关系，见表2。

2.2各组足趾肿胀体积比较 与对照组比较，造模后1、5、10 d模型组足趾肿胀体积明显增高(P<0.05)；与模型组比较，飞龙掌血各组、秋水仙碱组足趾肿胀体积均有不同程度降低(P<0.05)，呈时间-剂量依赖性关系，见表3。

表2 各组步态评分比较(n=10，分，

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与低剂量组比较：3)P<0.05；与中剂量组比较：4)P<0.05；与1 d比较：5)P<0.05；下表同

表3 各组足趾肿胀体积比较

2.3各组痛阈比较 与对照组比较，造模后1、5、10 d模型组痛阈明显降低(P<0.05)；与模型组比较，飞龙掌血各组、秋水仙碱组痛阈均有不同程度增高(P<0.05)，呈剂量依赖性关系，见表4。

2.4各组外周血IL-1β、IL-6和TNF-α、关节滑膜组织NF-κBp65比较 与对照组比较，模型组外周血炎症因子和关节滑膜组织NF-κBp65明显增高(P<0.05);与模型组比较，飞龙掌血各组、秋水仙碱组外周血炎症因子和关节滑膜组织NF-κBp65均有不同程度降低(P<0.05)，呈剂量依赖性关系，见表5和图1。

表4 各组痛阈比较

表5 各组外周血IL-1β、IL-6和TNF-α、关节滑膜组织NF-κBp65表达比较

图1 各组关节滑膜组织NF-κBp65表达(免疫组化，×200)

2.5各组关节滑膜组织中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达比较 与对照组比较，模型组关节滑膜组织中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA明显增高(P<0.05)；与模型组比较，飞龙掌血各组及秋水仙碱组关节滑膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA均有不同程度降低(P<0.05)，呈剂量依赖性关系，见图2和表6。

1.对照组，2.模型组，3.飞龙掌血低剂量组，4.飞龙掌血中剂量组，5.飞龙掌血高剂量组，6.秋水仙碱组图2 各组关节滑膜组织中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达

组别IL-1βIL-6TNF-α对照组0.21±0.110.21±0.110.22±0.12模型组1.02±0.221)1.21±0.531)0.81±0.241)飞龙掌血低剂量组0.71±0.212)0.71±0.352)0.64±0.26飞龙掌血中剂量组0.72±0.202)0.62±0.342)0.52±0.372)飞龙掌血高剂量组0.61±0.302)0.31±0.152)3)0.41±0.152)3)秋水仙碱组0.42±0.112)0.24±0.132)3)0.37±0.182)3)F/P值19.826/0.00015.469/0.0007.943/0.000

3 讨 论

痛风以高尿酸血症为特点，发作突然，引起急性痛风性关节炎，疼痛难忍而就医治疗，严重影响了患者的生活质量〔6，7〕。痛风急性发作期治疗主要在于减轻及改善患者的肿胀和疼痛症状，西医主要采用糖皮质激素或秋水仙碱等药物治疗，虽然能有效地缓解疼痛症状，但对肝、肾及胃肠均有感染而引起不良反应，其中秋水仙碱存在明显的肾脏及骨髓毒性，对反复发作的痛风性关节炎或伴有肾功能不全的患者限制使用。

我国苗族应用飞龙掌血在治疗风湿痹痛均有一定疗效。本课题显示，飞龙掌血能够改善AGA大鼠步态评分及足趾肿胀体积，可见飞龙掌血可用于治疗AGA作用与飞龙掌血的有效成分密切相关〔8～12〕。飞龙掌血生物总碱、水提液和醇提液均具有明显的抗炎作用，飞龙掌血的水、醇提取物均能缓解醋酸所致小鼠疼痛，且镇痛作用相当或超过盐酸哌替啶，原因在于飞龙掌血的水和醇提物可增加脑的β-内啡肽蛋白表达实现的，β-EP是体内产生的一类具有类似吗啡作用的内源性肽类物质。

NF-κB信号是人体免疫系统抵抗微生物病原体的重要机制，TNF受体相关因子6可参与多条信号转导通路，形成受体连接蛋白复合物并激活NF-κB诱导激酶，暴露NF-κB的核定位信号，进而上调炎症因子表达，如IL-1β。上调的IL-1β可迅速活化血管内皮细胞表达细胞黏附分子，诱导粒细胞及巨噬细胞，刺激单核-巨噬细胞加快合成IL-6与TNF-α。IL-1β作为炎症趋化因子和激活因子，存在于关节组织中最经典的炎症细胞，在痛风性关节炎的发生、发展过程中发挥关键作用〔13〕。本课题提示AGA鼠的NF-κB信号通路处于激活状态。飞龙掌血可干预NF-κB信号通路，类似的文献也有报道〔14～16〕，如飞龙掌血提取物及所含的呋喃型香豆素、异戊烯基的简单香豆素、苯并菲唆类生物碱和呋喃喹啉类生物碱均可显著降低脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞产生的炎症因子IL-6和TNF-α水平，飞龙掌血提取物可抑制关节炎各种细胞中NF-κB的转录水平，调节细胞对炎性介质的释放并抑制与炎症相关酶的活性和表达，参与类风湿关节炎的免疫细胞的增殖及活化。

综上，苗药飞龙掌血具有治疗AGA的作用，与降低外周血IL-1β、IL-6和TNF-α及关节滑膜组织中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA及 NF-κBp65有关，这些药理机制与飞龙掌血的化学成分有关。