萱草属植物花蕾中的秋水仙碱HPLC测定

王金耀，党换梅

（1山西农业大学园艺学院，山西太谷 030801；2山西省设施蔬菜提质增效协同创新中心）

萱草属（Hemerocallis spp.）植物是百合科多年生宿根草本，多数分布于亚洲温带至亚热带地区，不仅具有观赏价值，还具有较高食用价值[l,2]。萱草属植物以其特有的观花、食用、药用等功能引起国内外研究人员的重视，科学家们针对萱草属植物的资源分布、繁殖育种、栽培应用以及推广等方面做了多方面研究[3]，随着人们对萱草属植物的深入研究，以及实际生活中食用萱草属植物过称中引发的中毒现象[4,5]，进一步揭示了萱草属植物中含有秋水仙碱。汪乃兴、赵滨等以水为提取剂，利用差示脉冲极谱法在花蕾中检测到秋水仙碱[6]。刘陈力为等在黄花菜中提取得到秋水仙碱[7]。

萱草属植物因其含有秋水仙碱而造成鲜食时容易中毒，甚至危害生命。因此，针对萱草属植物的蔬菜学评价中，秋水仙碱含量的高低直接影响其营养品质的优劣。本研究利用高效液相色谱法（HPLC）测定了2012年前后收集到的17份萱草属植物中秋水仙碱含量，以期为萱草属植物蔬菜学评价体系的建立提供依据。

表1 供试材料引种信息

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验供试材料取自山西农业大学萱草种质资源圃（见表1），花期采收完整花蕾，45℃烘干，打磨成粉备用。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制。准确称取秋水仙碱标准品20mg（纯度98%），加入1mL色谱级甲醇配制成20mg/mL的储备液，使用时吸取少量进行稀释。

1.2.2 色谱条件的确定。依据台海川[8]采用RP-HPLC法建立秋水仙碱含量的测定体系（Waters C18（150mm×4.6mm，5um）、流动相比例甲醇∶水=44∶56、流速 1 mL/min、柱温 25℃、进样量20μL），对秋水仙碱的测定波长进行选择与确定。在190～600nm波长范围内进行紫外扫描，确定其最佳检测波长。

1.2.3 样品检测。秋水仙碱提取采用超声波提取法，含量测定采用高效液相色谱法[9]。参考课题组张宁建立的体系制备秋水仙碱待测样[10]，利用Thermo Fisher U3000 HPLC高效液相色谱系统对样品进行检测。

2 结果与分析

2.1 优化色谱测定条件

2.1.1 最优检测波长检测波长的确定。利用HPLC对5μg/mL的秋水仙碱标样在设定波长范围内（190～600nm）进行3D扫描，结果发现该标准样品在243nm与350nm有最大吸收（见图1）。5μg/mL秋水仙碱图1标准样的HPLC图谱（243nm和350nm）标准溶液在243nm与350nm处的出峰时间分别为4.933min与4.923min，243nm处的峰高和峰面积分别为4.510和1.726，而350nm处的峰高和峰面积分别2.370和0.868，相比较可知，秋水仙碱在243nm处的灵敏度高。

进一步分析色谱峰的峰型可以看出，标准溶液在243nm处检测的所需组分（图1中的组分5）峰前有1个小峰（组分4）干扰，而在350 nm处检测出的秋水仙碱组分峰前没有小峰干扰。为了避免干扰，减少误差，提高试验方法与结果的准确性，本研究选定350nm为秋水仙碱的检测波长。

图1 秋水仙碱标准样的HPLC图谱

2.1.2 线性回归关系线性关系考察。吸取少量储备液，配制 0.1、0.2、0.3、0.4和0.5μg/mL的秋水仙碱标准梯度溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到秋水仙碱标准系列溶液的回归曲线（见图2），回归方程为 Y=0.7939X-0.0218，R2=0.999。

图2 秋水仙碱的标准曲线图

图3 标准溶液与供试样品的高效液相色谱图

2.1.3 样品测定。利用高效液相色谱法对秋水仙碱标准液和‘野生黄花1号’花蕾提取液进行测定（见图3）。由图3可知，标样中秋水仙碱峰的出峰时间为4.920min，而在试样中的出峰时间受到前后组分的影响而出峰时间提前为4.797min，但满足出峰时间前后相差在5%的范围。为进一步对秋水仙碱组分进行确定，在供试样品提取过程中，加入一定量的标准品溶液，对比保留时间是否出现差异。结果发现，在试样中加入一定浓度的秋水仙碱标准品，试样仍然在同一时间（4.794min）出峰，但是信号值明显提高，故可以确定试样中的组分1和标样中的组分1同为秋水仙碱。

2.2 系统适应性试验

2.2.1 精密度试验。取20μL的0.5μg/mL秋水仙碱标准溶液和‘金娃娃1号’溶液试样连续进样7次，测定秋水仙碱含量的相对标准差分别为0.53%和1.23%，表明仪器进样的精密度能够达到实验要求。

2.2.2 稳定性试验。取20μL的0.5μg/mL秋水仙碱标准溶液和‘金娃娃1号’试样溶液分别在0h、2h、4h、6h进样测定，标样与试样中秋水仙碱含量的相对标准差分别为2.78%和3.35%；进一步取20μL的0.5μg/m秋水仙碱标准溶液和试样（‘金娃娃1号’）溶液分别在0、1、2、3d进样测定，标样相对标准差为2.96%，试样相对标准差为3.23%。结果表明，秋水仙碱含量在3d内稳定性良好。

2.2.3 可行性分析。取20μL的0.5μg/m秋水仙碱标准溶液和‘金娃娃1号’试样溶液分别在45℃保温箱与4℃冰箱中放置0d、2d、4d、8d进样测定，标样的相对标准差为2.87%，试样的相对标准差为3.79%。结果表明标样与试样中的秋水仙碱含量温度稳定性良好。

2.3 不同萱草属植物中秋水仙碱含量比较

由表2可知，17份萱草属植物花蕾中只有9种萱草属植物中检测出秋水仙碱，其余8种萱草属植物花蕾中未检测出秋水仙碱。萱草属植物花蕾中秋水仙碱含量最高的是‘野生黄花1号’，为0.218μg/g，其次是‘北黄花’，为0.204μg/g。‘北黄花’中秋水仙碱含量与‘东庄黄花’和‘冲里花1号’中秋水仙碱含量存在显著差异，后两者分别为0.187μg/g和0.184μg/g；这两者又与‘金娃娃 1 号’、‘大荔黄花’、‘长嘴子花 1 号’、‘茄子花1号’和‘茶子花’花蕾中秋水仙碱含量存在显著差 异 ， 其 含 量 分 别 为 0.162μg/g、0.166μg/g、0.156μg/g、0.158μg/g和 0.164μg/g。而在其它 8 份材料中均未检测出秋水仙碱。

2.4 秋水仙碱含量与花色的相关性分析

由表3可知，17份萱草属植物材料中的秋水仙碱含量与花色的相关系数为-0.894，9种黄花材料的花蕾中均检测到秋水仙碱，其余8种红花材料的花蕾中均未检测到秋水仙碱。

3 结论与讨论

萱草属植物花蕾中秋水仙碱HPLC检测的最佳波长为350nm。在17份材料中，‘野生黄花1号’、‘北黄花’、‘东庄黄花’、‘冲里花 1 号’、‘金娃娃 1 号’、‘大荔黄花’、‘长嘴子花1号’、‘茄子花1号’和‘茶子花’等9份材料花蕾中检测出秋水仙碱，而其它8份材料均未检测出秋水仙碱。其中秋水仙碱含量最高的是‘野生黄花 1号’，为 0.218μg/g；其次是‘北黄花’，为0.204μg/g；含量最低的是‘长嘴子花 1号’，为0.156μg/g。进一步对花蕾中的秋水仙碱含量与花色进行了相关性分析，结果表明相关系数高达-0.894。

萱草属植物中因含有秋水仙碱而被研究者关注，主要有两方面的原因：一是研究秋水仙碱的药理作用，二是为了探究萱草属植物花蕾食用的安全性[11-13]。关于秋水仙碱的测定方法已有报道，有差示脉冲极普法[14]、伏安法[15]、荧光法[16]以及 HPLC[17-19]法，以 HPLC 居多。本研究通过3D扫描，在200～400nm内检测到两处秋水仙碱最大吸收峰，其对应波长分别为243nm和350nm。其中在243nm处检测的秋水仙碱色谱峰的前面有小峰干扰，而350nm处的秋水仙碱色谱峰既没有其他峰干扰，也无拖尾现象，这与刘桂花等[20]用HPLC法测定复方苏润江滴丸中秋水仙碱和卞晓岚等[17]利用高效液相色谱法测定复方秋水仙碱胶囊中秋水仙碱含量时的波长选择的选定相一致，同时符合国标法[21]中测定秋水仙碱的波长选择。

表2 供试样品中秋水仙碱含量

表3 花色与秋水仙碱含量之间的相关系数

研究报道，临床上，秋水仙碱中毒者多因过量摄入含有秋水仙碱的黄花菜，或者长期服用含有秋水仙碱药片所致[22]，短期血液中秋水仙碱量达0.5mg/kg，致死率上升[23]。在17份萱草属植物花蕾中，有9种萱草属植物中检测出秋水仙碱，含量最低和最高的分别是‘长嘴子花1号’和‘野生黄花1号’，分别为0.156μg/g和0.218μg/g，而在其它8种萱草属植物花蕾中均未检测出秋水仙碱，原因可能是因为这几种萱草属植物中秋水仙碱含量本身极低或不含秋水仙碱，尚需更精确的方法对其进行测定。

本研究结果显示，秋水仙碱含量与花色的相关系数为-0.894，其中‘潘龙花’为黄色花，未检测出秋水仙碱，故在食用前不能单靠花色来区分鲜黄花菜是否含有秋水仙碱。

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