Esculetin对缺血性脑损伤大鼠神经的保护作用

曾尤超 姜 芮 刘 涛 范瑞明

(遵义医学院附属医院脑血管病科，贵州 遵义 563003)

缺血性脑卒中发病率和死亡率在世界范围内位居前列〔1〕，主要发病机制为脑组织失血、缺血或者缺氧，导致脑细胞功能的减退及能量代谢能力发生损伤，乃至诱导脑细胞凋亡和坏死〔2〕。对缺血性脑损伤的治疗一直是人类生命医学领域研究的热点〔3,4〕。Escaletin(ESC)化学名为6，7-二羟基香豆素，俗称“七叶亭”，通用名：秦皮乙素，是从植物中提取分离出来的一种化合物，是秦皮的主要有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡及利尿、平喘等作用〔5,6〕，其相关衍生物(如华法林)还具有抗血小板聚集的疗效，目前华法林已广泛应用于临床缺血性脑卒中的抗凝治疗〔7～9〕，但关于ESC对减少缺血性脑损伤的报道还较少。本研究探讨ESC对缺血性脑损伤大鼠的神经保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SD大鼠85只，雌雄不拘，动物合格证号：SCXK(京)2009-0007，平均体重为(302.5±25.7)g，由第三军医大学大坪医院动物实验中心提供，均为SPF级别，饲养在遵义医学院。

1.2动物模型的构建 采用10%水合氯醛对大鼠进行腹腔注射麻醉，清除颈部毛发后，利用乙醇进行消毒；取大鼠颈中位置切口，使用动脉夹夹颈总动脉，钝性分离其右侧总动脉、颈内动脉及颈外动脉，结扎颈外动脉，于颈外动脉游离端剪开约5 mm小口，并在小口下系一松结，从切口处插入制备好的线栓将颈外动脉游离端向外上方拉伸，插入深度17～19 mm，阻塞大脑中动脉导致脑缺血，然后再对入口处结扎。参考 Longa 等〔10〕对大鼠神经功能进行评分，1～3分视为造模成功。

1.3动物模型分组及ESC给药处理 将构建成功的大鼠模型均分为ESC处理组和模型组，同时选取等数量的SD大鼠作为阴性对照组，其中ESC处理组大鼠于脑缺血模型建立后给予ESC 5 mg·kg-1·d-1灌胃，ESC混悬液浓度为2.5 mg/ml；而模型组给予生理盐水5 mg·kg-1·d-1灌胃，所有实验大鼠给药1次。

1.4脑组织2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色 断头取脑，去除嗅脑、脑干、小脑，然后每隔2.5 mm距离切取冠状组织片，一般切5～7片。然后将组织于质量分数为2.0%～2.5%的TTC染液中进行染色，在37℃孵育 20～40 min，显色完全后进行拍照。用图像处理软件(NIS-ElementsBR)分析图像，计算出梗死面积百分比。

1.5酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 通过ELISA检测脑组织Toll样受体(TLR)4、核因子(NF)-κB及胶质细胞源性生长因子(GDNF)的表达情况，具体操作步骤及方法严格按试剂盒生产厂家所提供的说明书进行。

1.6超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)活性测定 用含0.5%胰酶、0.05%乙二胺四乙酸(EDTA)的消化液消化细胞，收集好细胞后加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液在冰上进行裂解细胞，裂解好细胞后，提取细胞总蛋白，进行蛋白定量；采用黄嘌呤氧化酶法测定梗死脑组织SOD活性，应用硫代巴比妥酸法测定脑组织及血清MDA含量〔11〕；测定操作步骤及方法严格按试剂盒(南京建成科技有限公司)说明书进行。

1.7统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1大鼠模型构建结果 在大鼠建模过程中，1只大鼠死亡，对剩下的84只模型大鼠进行评分，共有76只(89.41%)造模成功。将76只大鼠模型随机均分为ESC处理组和模型组，其中ESC处理组大鼠平均体重(297.2±17.3)g，雄性29只，平均周龄(4.4±1.4)w，神经功能评分为(2.37±0.25)分。模型组大鼠平均体重为(306.8±18.2)g，雄性26只，平均周龄为(4.2±1.3)w，阴性对照组体重(302.7±19.1)g，雄性24只，周龄(4.3±1.4)w，神经功能评分(0.37±0.09)分。各组周龄、体重、性别相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2ESC对缺血再灌注损伤后大鼠脑组织形态学的影响 阴性对照组无显著脑梗死出现，模型组大鼠出现严重梗死面积，而ESC处理组大鼠虽然出现了部分脑梗死，但是其脑梗死面积明显小于模型组(P<0.05)，见图1，且神经功能评分〔(1.52±0.17)分〕相比于模型组〔(2.23±0.26)分〕也显著降低(P<0.05)。

图1 各组大鼠脑组织TTC 染色结果

2.3ESC对缺血再灌注损伤后大鼠脑组织TLR4/NF-κB信号转导通路的影响 与阴性对照组比较，模型组TLR4表达显著提高，NF-κB的表达也显著增强(P<0.05)；在进行ESC药物处理后，能够显著降低TLR4与NF-κB表达水平(P<0.05)。见表1。

表1 各组脑组织TLR4与NF-κB表达

与阴性对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

2.4ESC对缺血再灌注损伤后大鼠脑组织GDNF表达的影响 经ESC药物处理后，模型组大鼠脑组织中GDNF的表达显著增强(P<0.05)。见表2。

2.5ESC对缺血再灌注损伤后大鼠脑组织中MDA，SOD的影响 与模型组比较，ESC处理后，大鼠SOD酶活性显著升高；而MDA的酶活性显著降低(P<0.05)。见表3。

表2 各组大鼠脑组织GDNF表达

与模型组比较：1)P<0.05，下表同

表3 各组大鼠脑组织SOD与MDA酶活性

3 讨 论

脑血管疾病在我国居民疾病死亡原因中已位居第一位，是严重危害人类健康的疾病之一〔12〕。存活者中大约60%的患者遗留瘫痪、失语等严重生理缺陷〔13〕。缺血性脑卒中是脑血管疾病中的最常见者，其一旦发生，致残率较高，给社会和家庭带来沉重负担〔14〕。

Cao等〔15〕在TLR4缺失的大鼠脑缺血再灌注损伤模型中发现了肿瘤坏死因子(TNF)-α，白细胞介素(IL)-1β等炎性因子表达减少，说明TLR4与脑缺血再灌注的炎性反应有关。并且研究发现，诸多器官，如肝脏，心脏的缺血再灌注与TLR4的表达密切关系〔16，17〕。本研究显示，缺血再灌注大鼠。在用ESC处理后，TLR4与NF-κB的表达都能被显著降低，说明ESC对脑缺血再灌注损伤的缓解，是通过TLR4/NF-kB信号转导通路来发挥抗炎作用，以减轻脑损伤。

SOD是一种抗氧化酶，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，提高SOD的表达，可以加强机体抗氧化功能〔18〕。MDA是自由基氧化损伤后脂质过氧化的代谢产物，会对机体蛋白质的合成造成不良影响，它的升高代表机体损伤严重〔19〕。本研究结果显示，ESC处理后，缺血再灌注损伤大鼠SOD酶活性显著升高，MDA酶活性显著降低。且ESC处理能够显著提高GDNF的表达，发挥多效能的神经营养作用。