双歧杆菌细菌素bif i docin A对大肠杆菌细胞总蛋白表达的影响

刘国荣，李 雪，王成涛*

（北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京工商大学，北京 100048）

乳酸菌细菌素是乳酸菌在生长代谢过程中通过核糖体机制合成并分泌到环境中的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白类物质，它在人体内可被降解，具有高效、无抗药性、无毒、无残留等优点，已成为益生菌生物活性代谢产物研究与开发的热点[1]。

对乳酸菌细菌素抑菌作用机制的研究是评价其在食品中应用安全性的重要依据之一。目前已有报道从抑菌作用方式和敏感菌细胞膜通透性等方面开展了乳酸菌细菌素抑菌机理研究[2-3]，已基本明确细菌素对革兰氏阳性（G+）细菌的主要作用机制是改变敏感菌细胞膜通透性，释放胞内离子及紫外吸收物质，耗散质子驱动势，干扰膜运输，最终引起细胞死亡。但是随着研究的深入，部分学者发现细菌素对敏感菌的抑菌作用还与其细胞内能量代谢及糖类转运系统等部分相关蛋白表达有关。如Bendali等[4]通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）发现干酪乳杆菌素处理后李斯特菌细胞内少数蛋白表达量明显下降，但未对这些蛋白进行鉴定，对造成这种现象的原因也未给出合理解释；Ramnath等[5]研究发现，细菌素mesentericin Y105对单核细胞性李斯特菌的抑制作用与受体细胞中甘露糖特定磷酸转移酶系统有关。鉴于此，有必要从蛋白表达水平进一步探究乳酸菌细菌素的抑菌作用机理。

从研究对象看，目前细菌素抑菌机制的研究主要围绕G+细菌展开，如单核细胞性李斯特菌、金黄色葡萄球菌，而对革兰氏阴性（G-）细菌的抑菌机制研究报道极少。这是由于多数乳酸菌细菌素仅对近缘的G+细菌有抑菌活性，而只有少数细菌素报道可抑制G-细菌的生长。目前已报道的可以同时抑制G+和G-细菌生长的细菌素有plantaricin ST31[6]、bacteriocin AMA-K[7]、plantaricin MG[8]、sakacin C2[9]、ent35-MccV[10]、lactocin MXJ 32A[11]以及bif i docin A[12]。探究这些广谱细菌素对G-细菌的抑菌作用机制对于乳酸菌细菌素的开发和利用具有重要科学意义[13]。

动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）BB04分离自中国新疆于田长寿老人肠道，是国内外首次报道的产细菌素动物双歧杆菌，可代谢合成新型双歧杆菌细菌素bifidocin A，该细菌素对多株食源性G+和G-病原菌均表现抑菌活性，且食品加工适应性好，有作为天然食品生物防腐剂的巨大应用潜力，前期课题组已对该细菌素的分子结构、特性及合成条件进行了系统研究[12,14]，并从抑菌作用方式、敏感菌细胞膜通透性及细胞结构完整性角度对其抑菌机理进行探索[15-17]。为进一步从蛋白表达水平探讨该细菌素对G-菌的抑菌作用机理，本研究采用双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）联合蛋白质基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（matrix assisted laser analytical ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术分析细菌素bifidocin A处理前后G-大肠杆菌1.90细胞总蛋白表达差异情况，并在基因本体论（Gene Ontology，GO）注释基础上，对差异蛋白进行功能分类及富集分析。研究结果对于全面解析乳酸菌细菌素的抑菌机制具有重要科学意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种及培养基：细菌素bifidocin A纯品（质量浓度为1.85 mg/mL，纯度为95.3%），产生菌为动物双歧杆菌（B. animalis）BB04，由本实验室自主分离提取纯化[12-16]；敏感菌：大肠杆菌（Escherichia coli）CGMCC1.90 中国普通微生物菌种保藏管理中心；LB培养基 北京陆桥技术有限责任公司。

IPG胶条（pH 3～10，24 cm）、SYBR Green实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒 美国Bio-Rad公司；RNA提取试剂盒、尿素、硫脲、二硫苏糖醇、Tris-HCl（pH 8.8）缓冲液、过硫酸铵、矿物油 北京半夏科技有限公司。

1.2 仪器与设备

XO超声波细胞破碎仪 南京先欧仪器制造有限公司；QL-901旋涡振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；PROTEAN IEF Cell等电点聚焦仪、Illumina Eco™实时荧光定量仪 美国Bio-Rad公司；电泳仪、Image Scanner扫描仪 美国GE公司；4800 Plus MALDI TOF MS仪美国AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 敏感菌培养及细菌素bif i docin A处理菌悬液的制备[14]

收集培养至对数生长期的大肠杆菌1.90菌体细胞，用0.1 mol/L（pH 7.0）的羟乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）缓冲液反复洗涤3 次后，重悬于0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸缓冲液中，制备成106CFU/mL菌悬液，并向其中加入适量细菌素bif i docin A纯品溶液，使最终作用浓度为最低抑菌浓度水平（0.019 mg/mL），37 ℃温育处理2 h。以未添加细菌素的大肠杆菌菌悬液作为对照。

1.3.2 敏感菌细胞总蛋白提取

取20 mL细菌素处理前后的大肠杆菌菌悬液，4 ℃、10 000 r/min离心10 min去除上清液，用1～2 mL的溶解缓冲液（7 mol/L尿素，2 mol/L 硫脲，4% 3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐，1%蛋白酶抑制剂）将菌体细胞重悬，反复冻融3 次，在冰上超声15 min。4 ℃、12 000 r/min离心30 min去除没有破碎的细菌。通过Bradford法测定蛋白浓度，并在-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3.3 2-DE

1.3.3.1 第1向固相pH梯度等电聚焦电泳（isoelectric focusing，IEF）

将500 μg敏感菌总蛋白提取物溶解在水化液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% 3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐，20 mmol/L二硫苏糖醇，65 mmol/L Tris，0.2% Bio-Lyte(3-10)，1%溴酚蓝）中，使终体积为250 μL。充分混合后将其加入到IPG胶条（pH 3～10，24 cm）内溶胀12 h，然后将IPG胶条放入IEF仪，胶条上滴加一定量的矿物油。按以下参数和程序完成IEF：500 V，1 h；1 000 V，1h；8 000V，4 h；2 000 V，10 h；500 V维持（每胶条电流50 mA）。

1.3.3.2 第2向垂直板SDS-PAGE

将IEF完毕后的IPG胶条分别在平衡缓冲液I（6 mol/L尿素、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）、20%甘油、2% SDS、1%二硫苏糖醇）和平衡缓冲液II（6 mol/L尿素、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）、20%甘油、2% SDS、2.5%碘乙酰胺）中各平衡15 min；将IPG胶条转移到SDSPAGE上，用低熔点琼脂糖封胶液封闭。凝固后进行SDSPAGE，分离胶质量分数为12.5%，浓缩胶按15 mA、分离胶按30 mA进行电泳，至指示线到达胶底部。

1.3.4 凝胶染色及图像采集分析

SDS胶用考马斯亮蓝G250染色2 h，脱色过夜。图像采集使用Image Scanner扫描仪扫描凝胶。获取图像后，使用PD Quest 8.0对比分析扫描获得的凝胶图像，进行蛋白点的辨识以及匹配，比对蛋白丰度，寻找差异蛋白点并进行编号。

1.3.5 差异蛋白MALDI-TOF MS鉴定

从凝胶中切下差异倍数在1.5 倍以上的蛋白点进行MALDI-TOF MS分析，测定前用胰蛋白酶水解样品。并将所得肽段信息通过Mascot检索NCBInr数据库进行蛋白质鉴定。

1.3.6 差异蛋白qRT-PCR分析

为了进一步了解差异表达蛋白对应基因的表达模式，并评价其mRNA水平与蛋白质水平上表达相关性，采用qRT-PCR技术对质谱鉴定出的10 个目标差异蛋白进行了转录水平分析。PCR引物根据NCBI提供的序列，采用Primer 3在线设计软件设计引物，具体信息见表1；选择编码大肠杆菌3-磷酸甘油醛脱氢酶gapA作为内参基因，数据分析采用2－ΔΔCt（Livak）法[18]。

表1 qRT-PCR所用引物Table1 Primers used in qRT-PCR

1.3.7 差异蛋白GO注释分析

检索GO数据库的GO号，基于序列相似性，通过BLAST找到与实验结果序列相似的模式生物蛋白，分别从细胞组成、生物过程和分子功能3 个方面，对差异蛋白质在功能方面进行分类统计。

2 结果与分析

2.1 敏感菌细胞总蛋白2-DE结果

经蛋白定量，大肠杆菌1.90细胞总蛋白样品的电泳上样量为1.16 mg/mL。细菌素bifidocin A处理前后大肠杆菌细胞总蛋白的2-DE图谱如图1所示，结果显示，未经细菌素处理的细胞总蛋白2-DE图谱中共分离到171 个蛋白点，而经细菌素处理后细胞总蛋白样品共分离到194 个蛋白点，这些蛋白点分子质量分布在10.23～96.67 kDa之间，等电点介于3.45～8.83之间；从等电点（pI）分布来看，大多数蛋白质集中在pI 6.0～8.0之间，其中在pI 3.0～5.0、5.0～6.0和6.0～8.0之间分别有79、51 个和23 个蛋白点；从分子质量分布来看，大部分蛋白点分布在110～30 kDa之间，110～80、80～50 kDa及30～50 kDa的蛋白点分别有25、109 个及23 个。以上结果都说明，细菌素处理前后大肠杆菌细胞总蛋白样品经2-DE得到了有效分离。

图1 细菌素bi fi docin A处理前（A）、后（B）大肠杆菌1.90细胞总蛋白的2-DE图谱Fig.1 2-DE pro fi les of whole proteins extracted from untreated E. coli 1.90 cells (A) and cells treated with bi fi docin A (B)

2.2 敏感菌细胞总蛋白匹配分析

图2 敏感菌细胞差异蛋白点2-DE图Fig.2 2-DE images of differentially expressed protein spots from cells treated with bif i docin A

使用PD Quest8.0软件对不同处理样品的凝胶图像进行匹配分析，选取蛋白丰度差异倍数在1.5 倍以上的差异蛋白点，结果见图2所示。经细菌素处理后大肠杆菌细胞总蛋白表达丰度存在一定差异，共筛选获得12 个差异蛋白点（图3）。将上述差异蛋白点通过Quantity Table Reports软件导出需要的差异蛋白点定量信息，以处理组与对照组样品中相应蛋白分子质量的比值为灰度值，当灰度值大于1时，认为该蛋白的表达发生了明显的上调；当灰度值小于1时，认为该蛋白的表达发生了明显的下调。结果表明，细菌素作用后大肠杆菌1.90细胞总蛋白中有10 个明显下调蛋白点（9001、3102、7001、1702、3506、7605、2706、7301、1604、2608），2 个明显上调蛋白点（6203、3205）。

图3 bif i docin A处理前后大肠杆菌差异蛋白点局部放大图Fig.3 Close-up of differentially expressed protein spots from E. coli cells untreated and treated with bif i docin A

2.3 差异蛋白质谱鉴定及分析

对12 个差异表达蛋白点进行MALDI-TOF MS分析与鉴定，结果如表2所示。置信区间能达到99%以上的蛋白点有10 个（除3102和3506外），说明这10 个点的测序和鉴定结果比较可靠。其中，2 个表达上调蛋白分别为外膜蛋白OmpA和外膜蛋白OmpW；8 个表达下调蛋白分别为抗酸分子伴侣蛋白HdeA、烷基氢过氧化物还原酶亚基、DNA复制蛋白PriB、分子伴侣蛋白DnaK、延胡索酸还原酶、依赖DNA的RNA聚合酶亚基、肌苷单磷酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶。

表2 MALDI-TOF MS鉴定的差异表达蛋白Table2 Differentially expressed proteins identi fi ed by MALDI-TOF MS

2.4 差异表达蛋白qRT-PCR分析

为了验证2-DE差异蛋白质组学的分析结果，对10 个差异表达蛋白进行转录水平的qRT-PCR验证，结果见图4所示，可以看出这些基因的表达水平变化与蛋白表达的上调或下调趋势一致，但差异表达倍数略微不同。这些结果说明，差异表达蛋白的转录水平与蛋白表达水平变化基本一致。

图4 差异表达蛋白的qRT-PCR分析Fig.4 qRT-PCR assay of differentially expressed proteins

2.5 差异表达蛋白的GO功能注释

图5 差异表达蛋白的GO功能分类统计Fig.5 Gene ontology prof i les of differentially expressed proteins

如图5所示，涉及细胞组成的有2 个蛋白，分别为外膜蛋白OmpA和外膜蛋白OmpW，它们都与维持细胞膜形态和结构有关[19-21]，这与之前本课题组从细胞水平揭示的细菌素抑菌机理一致，细菌素作用的主要部位是在敏感菌细胞膜上[14]。涉及生物过程有7 个蛋白，分别为抗酸分子伴侣蛋白HdeA、烷基氢过氧化物还原酶AhpR、DNA复制蛋白PriB、分子伴侣DnaK、延胡索酸还原酶、肌苷单磷酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶，其中，延胡索酸还原酶和琥珀酸脱氢酶参与三羧酸循环中延胡索酸和琥珀酸之间的转化[22-23]，肌苷单磷酸脱氢酶是核苷酸合成途径的关键酶[24]，细菌素处理后这3 个蛋白的表达量都降低，说明细菌素可能一定程度阻断了敏感菌细胞的三羧酸循环，减少三磷酸腺苷合成前体，从而降低能量提供，这与之前从细胞膜通透性角度揭示的细菌素抑菌机理一致，细菌素处理后敏感菌胞内能量代谢受到影响，三磷酸腺苷含量明显下降[14]；抗酸分子伴侣蛋白HdeA、烷基氢过氧化物还原酶AhpR和分子伴侣DnaK都是作为全局胁迫调节子适应胁迫条件的蛋白质[25-28]，细菌素处理后这些蛋白表达量的降低，说明细菌素处理后细胞对外界胁迫条件的抵抗能力下降；DNA复制相关蛋白PriB，是大肠杆菌中参与DNA复制重启反应的相关蛋白[29-30]，其表达量下降说明细菌素可能对敏感菌DNA复制功能有影响。涉及细胞基因转录过程的有1 个蛋白，为依赖DNA的RNA聚合酶。

3 结 论

本研究采用2-DE联合蛋白质MALDI-TOF MS技术分析细菌素bif i docin A处理前后G-大肠杆菌1.90细胞总蛋白表达差异情况，并对差异表达蛋白进行GO功能分类及富集分析，旨在从蛋白表达水平进一步探讨该细菌素对G-菌的抑菌作用机理。研究结果显示细菌素bif i docin A可能是通过改变细胞膜结构、阻断三羧酸循环、减少能量及ATP提供以及降低细胞对外界胁迫条件的抵抗能力等来达到对敏感G-菌的抑菌效果。但是，细菌素对差异表达蛋白的具体作用机制以及差异表达蛋白之间的相互关系仍然不明确，未来需要进一步探索研究。