国产氟多功能模块自动化合成18F-6-氟-L-DOPA及其临床初步应用

付华平，张晓军，麻广宇，刘 健，徐晓丹，徐白萱，张锦明

(中国人民解放军总医院 核医学科，北京 100853)

对分化良好、糖代谢水平低的神经内分泌肿瘤(NETs)，18F-6-氟-L-DOPA(18F-DOPA)比18F-FDG具有更高的诊断价值[1]，欧洲将18F-DOPA写入神经内分泌肿瘤诊断指南[2]。但由于亲电合成需要气体靶，且放化产率低和含载体，而亲核合成工艺复杂[3]，18F-DOPA在临床推广应用有一定的难度。近年来，亲核取代法合成18F-DOPA取得了较大的进展，除间接亲核取代后采用手性催化剂合成18F-DOPA外，直接亲核取代水解合成18F-DOPA方法简单、重复性好，且不含载体、产品手性纯度高，受到临床的欢迎。文献报道了多种直接亲核取代合成18F-DOPA的方法，其中以碘盐或硼酸酯为前体的合成方法，可以在常规的氟多功能模块上实现大剂量、自动化的合成，使18F-DOPA在临床的广泛应用成为可能[4]。本研究在Tredwell等[5]的研究基础上，以6-硼酯-二甲氧基-DOPA为前体，铜盐Cu(OTf)2(py)4为催化剂，在国产氟多功能模块上实现了简单、快速合成18F-DOPA，经质控和伦理审批后，进行了初步的临床评价。

1 实验材料

1.1 主要试剂

6-硼酯-二甲氧基-L-DOPA和铜盐Cu(OTf)2-(py)4：德国ABX产品；19F-6-氟-L-DOPA标准品：加拿大TRC公司；Sep-Pak Light QMA柱、SEP-PAK C18柱：美国Waters公司；氧-18水(H18O丰度大于97%)、氨基聚醚(kryptofix，K2.2.2)：江苏华益科技有限公司；碳酸钾(K2CO3)：纯度>99.997%，美国STREM公司；氢氧化钠(NaOH)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸(CH3COOH)、抗坏血酸、丙酮：分析纯，北京化学试剂公司产品； 无水乙腈(CH3CN)：纯度>99.9%，美国Aldrich公司产品；57%氢碘酸(HI)：AR，百灵威化学试剂。

1.2 主要设备

Sumitomo HM-20S回旋加速器：日本住友公司；PET-MF-2V-IT-Ⅰ型氟多功能合成模块：派特(北京)科技有限公司；高效HPLC分析仪：美国Waters公司，配515泵，2487紫外检测器，Phenomenex Gemini 100 A C18 (4.6 mm×150 mm)分析柱，BioScan流动放射性检测器；Discovery ST64 PET/CT扫描仪：美国GE公司；便携式内毒素快速检测仪：美国Charles River公司；电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)：德国斯派克分析仪器公司；Bante321-Cu便携式铜离子浓度计：上海般特。

1.3 动物实验

正常雄性NIH小鼠5只，6～8周龄，(20±5) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2015．0001。

1.4 临床患者

经本院伦理委员会同意(批准号：S2017-128-01)，正常受试者：男性一例，52岁；胰岛细胞瘤复发患者：女性一例，22岁；签署知情同意书。

2 实验方法

2.1 18F-DOPA的自动化合成

使用PET-MF-2V-IT-Ⅰ型氟多功能合成模块合成18F-DOPA，合成线路示于图1。具体步骤：加速器经18O(p,n)18F反应得到18F-由N2载带至QMA捕获，用1.0 mL K2.2.2/K2CO3淋洗液(由5.50 g/L K2CO3水溶液0.2 mL和18.75 g/L K2.2.2乙腈溶液0.8 mL混合而成)将18F-从QMA柱洗入1号反应管，通入N2并加热115 ℃除水至干，再将2 mL乙腈加入反应管继续通气加热除水至干燥。10 mg 6-硼酯-二甲氧基-DOPA/10 mg Cu(OTf)2(py)4)溶于0.7 mLDMF溶液中，加入1号反应管，110 ℃密闭亲核取代反应10 min后，加10 mL水稀释反应液，并将中间体转移至SEP-PAK C18柱，用5 mL丙酮分两次把中间体洗脱至2号反应管，加热除丙酮至残余0.1 mL，加入0.5 mL 57%的HI，160 ℃加热水解10 min，冷却后加入4 mL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液中和，混合液转至中转瓶，利用HPLC分离纯化，分离柱为Grace Alltima C18(10 mm×250 mm)，流动相为0.1%乙酸水溶液(含1 g/L抗坏血酸)，流速为4 mL/min，产品放射性峰收集后直接通过除菌滤膜得到最终产品。

图1 亲核法合成18F-DOPA示意图Fig.1 Nucleophilic synthesis of 18F-DOPA

2.2 18F-DOPA的质量控制

观察产品颜色及澄清度；利用精密pH试纸测量酸碱度；利用分析型HPLC测量放化纯度(分析柱为phenomenex luna C18 5 u(4.6 mm×150 mm)，紫外波长为254 nm，流动相为0.1%乙酸水溶液，流速为1 mL/min)，再与标准品共进样鉴定产品；碘铂酸薄层检测产品中K2.2.2含量；气相色谱分析产品有机溶剂残留；便携式内毒素检测仪测量内毒素含量；电感耦合等离子体原子发射光谱仪测量产品中铜离子含量。

2.3 18F-DOPA体外稳定性

取三份18F-DOPA溶液并分别稀释至370 GBq/L，第一份不添加任何试剂，即原液①，第二份中加入乙醇，配成乙醇体积分数为1%的溶液②，第三份中加入VC，配成VC10 mg/mL的溶液③。用分析型HPLC(2487紫外检测器， BioScan流动放射性检测器)分别测定①、②、③于1、3、5 h的放化纯度，比较加入乙醇、VC和原液稳定性的不同。

2.4 药物异常毒性实验

取NIH小鼠5只，每只小鼠尾静脉注射0.2 mL 10 mCi/mL的18F-DOPA注射液，正常饲养，48 h观察是否正常。

2.5 临床PET/CT显像

正常对照人仅用18F-DOPA显像一次，而胰岛细胞瘤复发患者采用18F-FDG和18F-DOPA分别显像，中间间隔48 h。 显像方法如下：显像人员按体质量静脉注射4.07 MBq/kg18F-DOPA，安静环境下休息60 min后行全身PET/CT扫描，扫描范围从头部至股骨，PET图像采用三维采集模式采集。利用CT数据对PET图像进行衰减校正，PET图像重建采用OSEM法，CT重建采用标准重建法。对于胰岛细胞瘤复发患者，以ROI技术勾画肿瘤区域并计算SUVmax。

3 结果与讨论

3.1 18F-DOPA的自动化合成

图2 HPLC分离产品的放射性色谱图Fig.2 Radioactivity chromatograms of HPLC separation products

利用新型标记前体6-硼酯-二甲氧基-L-DOPA，在国产双管氟多功能模块自动化合成18F-DOPA，在制备HPLC上收集约7 min 时唯一放射性峰(图2)，由于流动相中加入了抗坏血酸，干扰了紫外吸收，无法检测紫外吸收峰。从氟-18离子到最终产品，合成耗时约为60 min，不校正合成效率为(10.0±2.3)%(n=6)，单次产量大于7.4 GBq，合成稳定性和可靠性高。连续成功合成14次。

间接亲核合成18F-DOPA的效率较高，大于30%，除合成步骤多、准备时间长外，还需采用手性催化剂，合成后需要鉴别D-DOPA的含量[6]。而直接亲核反应合成18F-DOPA步骤少，方法简单，产品为无载体，且前体为手性化合物，亲核和水解不会对产品的手性有影响，是目前研究的热点。Lee等[7]使用镍络合物类标记前体在室温下亲核生成18F-6-氟-L-DOPA，制备时间短，条件温和，但镍络合物前体合成较复杂，同时存在高价碘氧化剂；Hoepping[8]使用含有硝基的标记前体，通过亲核取代、Baeyer-Villiger、酸水解三步反应一锅法制得18F-DOPA，水解只需6 mol/L的盐酸，条件温和，放化产率较高；芳基碘翁盐类标记前体可进行配体交换形成氟化碘鎓，热分解后生成氟化物，Kuik等[9]利用二芳基碘鎓盐为前体制备18F-DOPA，得到比活度高的产品，但合成时间需要2 h；Tredwell等[5]以芳基硼酸酯为前体，以Cu(OTf)2(py)4为催化剂亲核取代制得18F-DOPA，该前体稳定易得，催化剂Cu(OTf)2(py)4已商品化，产品放化纯度和光学纯度都比较高，但需使用铜盐作催化剂，应使用适当的方法除去铜盐，保证产品中铜离子浓度在合格范围。本研究采用双BOC保护氨基的前体，在铜盐催化下，18F取代硼酯，在国产多功能模块上经亲核、水解和HPLC纯化，自动化得到可供注射的18F-DOPA。该方法的优点是合成前准备时间较短，操作简单，合成效率较合适。

3.2 18F-DOPA的质量控制

产品为无色透明溶液，pH为6～7；放化纯度大于99%，样品放射性峰保留时间与标准品紫外吸收峰保留时间一致(图3)；三批注射液样品中K2.2.2含量低于50 μg/mL(碘铂酸薄层未显色)；乙腈、丙酮含量均低于0.04%w/w，内毒素低于5 Eu/mL；连续三批产品中铜离子含量分别为：1.05×10-6、0.50×10-6和1.07×10-6，低于药典规定的注射剂中铜离子浓度25×10-6 [10]。本方法的质控关键点为铜离子含量，为了除去铜盐，在产品亲核取代后将半成品通过SEP-PAK C18柱纯化，用大量水冲洗C18柱，最后用丙酮将酯溶性的产品从C18柱上淋洗到第二反应管再水解；最终产品经半制备HPLC纯化。对比文献合成该类二步法显像剂时，由于采用一个反应管的多功能模块，一般将半成品转移到C18柱后，再从合适的淋洗液将产品淋洗回到原反应管；这种方法不但操作麻烦，而且不利于除铜离子。本研究的结果表明，双反应管可有效除去铜盐。为了方便实时测量，对比了Bante321-Cu便携式铜离子浓度计与ICP-AES的结果，基本一致，便携式铜离子浓度计适于产品的自检。

图3 分析型HPLC谱图Fig.3 HPLC spectrum of 6-18F-L-DOPA

3.3 18F-DOPA体外稳定性

18F-DOPA原液放化纯度为99.4%，室温放置5 h后放化纯度降为92.04%，临床使用会造成骨显像；加入VC或乙醇，5 h后放化纯度为98.4%，提高了产品的稳定性(表1)。

18F-DOPA本身不稳定，在含盐溶液中会自行氧化成活性醌类继而聚合成多巴色素，导致其放化纯度降低，加之放射性射线产生的自由基，可加速左旋多巴制剂的分解[11-12]。文献发现在大剂量、 高浓度下18F-FDG也不稳定，加入适量的稳定剂乙醇可以提高其稳定性[13]。本研究参考乙醇的作用，在产品中加入微量稳定剂乙醇或还原剂VC，均可以提高18F-6-氟-L-DOPA的稳定性。在实际操作中，因注射液中乙醇含量的限制，以加入VC更合适。

3.4 异常毒性实验

小鼠注射后48 h全部存活，未见异常毒性反应。

3.5 临床初步应用

L-DOPA是神经递质DP的原料，18F-L-DOPA浓集于纹状体，根据放射性的分布18F-DOPA在上世纪八十年代用于诊断帕金森病，但由于是代谢型显像剂，灵敏度不及受体类显像剂，近年来逐步被受体类显像剂如：123I-FP-CIT或18F-FP-CIT等取代。但由于其特有的靶向性，本研究首先在正常人上证实显像剂临床效果。结果表明，示踪剂特异性浓集于纹状体，证明了其靶向性。全身显像表明，放射性可浓集于胆囊，胰腺有一定的摄取，主要从泌尿系统排泄(图4)。

表1 18F-DOPA体外稳定性Table 1 Stability in vitro of 18F-DOPA

在胰岛细胞瘤复发患者18F-DOPA显像表明，MR所示占位区(C)，有放射性浓集(图5E,F)；而18F-FDG显像则为阴性(图5A,B)，最后再次手术证实，该占位为胰岛细胞瘤复发。

图4 正常男志愿者注射示踪剂60 min后显像Fig.4 Set of images of a 52 years old normal male volunteers

4 小结

本研究采用国产氟多功能模块，经改进双管法合成工艺，可简单、快速合成18F-DOPA，对推动国内18F -DOPA在临床上的应用具有较大的意义。