18F-DCFPyL的制备和初步临床应用

张晓军，付华平，李云钢，刘 健，何玉林，刘亚超，徐白萱，朱 虹，吴 江，崔孟超，张锦明

(1.中国人民解放军总医院 核医学科，北京 100853；2.内蒙古医科大学附属医院 核医学科，内蒙古 呼和浩特 010050；3.南京军区南京总医院 核医学科，江苏 南京 210002；4.北京师范大学 放射性药物重点实验室，北京 100875)

流行病学研究发现，近二十年我国男性前列腺癌发生率显著上升，一方面由于生活方式的改变和环境因素的恶化导致癌症发生率提高，另一方面，人们防癌意识的增强和健康检查的普及使前列腺癌患者的检出率增高，尤其是影像学技术的快速发展使早期前列腺癌的检出率极大提高[1]。前列腺特异性膜抗原(prostate-specifc membrane antigen, PSMA)又称谷氨酸羧肽酶，在正常前列腺以及前列腺增生细胞表面有所表达，在绝大多数前列腺癌细胞中明显上调，是前列腺癌特异性分子标志。放射性核素标记的PSMA小分子抑制剂在前列腺癌检查和治疗评价方面均展现出较大的临床应用价值[2]。基于药效基团谷氨酸-脲-赖氨酸(Glu-urea-Lys)，68Ga-PSMA-11是第一个谷氨酸尿素类小分子PET显像剂，具有良好的生物学分布特征，常在临床研究中作为对比探针，验证其他PSMA类分子探针的有效性[3-6]。但螯合剂HBED-CC无法连接治疗核素如177Lu或225Ac，且核素68Ga由发生器获取，半衰期短，68Ga具有较高的正电子能量使PET图像信噪比较低，其临床应用受到一定限制。18F是临床应用最广泛的正电子核素，18F-DCFPyL(2-(3-{1-羧基-5-[(6-[18F]氟-吡啶-3-羰基)-胺基]-戊基}-脲基)-戊二酸)也是基于Glu-urea-Lys结构开发的PSMA特异小分子显像剂，具有亲和力高，体内药代动力学良好的特征，临床对比发现其各项性能优于68Ga-PSMA-11[7-9]。本研究利用国产氟多功能模块，对比不同的中间体水解方法，建立可靠、稳定的18F-DCFPyL自动化合成方法，并进行生物学分布和安全性评价，经初步临床应用，获得18F-DCFPyL人体分布特征。

1 材料与设备

1.1 实验材料

1.2 实验设备

Sumitomo HM-20S回旋加速器：日本住友公司；PET-MF-2V-IT-I型氟多功能合成模块(配Alltech 626泵，Grace Alltima (10 mm×250 mm) C-18 柱)：派特(北京)科技有限公司；便携式内毒素快速检测仪：美国Charles River公司；分析型HPLC检测仪(配515泵，2487紫外检测器，Phenomenex Gemini C-18分析柱(5 μ，100 Å，4.6 mm×150 mm)，BioScan流动放射性检测器)：美国Waters公司；Hidex Automatic Gamma Counter：芬兰Hidex公司；Biography truepoint 64 PET/CT扫描仪：德国西门子公司；GC 7890型气相色谱仪和SS420X 工作站：上海天美公司；GHL-300型氢气发生器：北京汇佳精仪公司。

1.3 实验动物

正常雄性NIH小鼠20只，6～8周龄，(20±5) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2015-0001。

1.4 患者

该研究已通过中国人民解放军总医院伦理委员会审查。

一例入选者来自中国人民解放军总医院泌尿外科门诊病人，69岁，前列腺癌切除术后5个月生化复发患者1例，血清总PSA(total prostate-specific antigen, tPSA)为1.86 ng/mL，游离PSA(free prostate-specific antigen, fPSA)为0.106 ng/mL。

2 实验方法

2.1 18F-DCFPyL的制备条件

利用氟多功能模块，18F-DCFPyL注射液的制备主要经由以下步骤。合成路线示于图2。

(1) 无水18F-的制备。加速器经18O(p, n)18F反应得到18F-，由N2气体载带至QMA柱(QMA柱预先以10 mL 0.075 mol/L TBAHC和10 mL纯水活化)，0.9 mL淋洗液(0.3 mL 0.075 mol/L TBAHC和0.6 mL乙腈)将18F-淋洗至反应管，通入N2并加热至116 ℃将液体除干，2 mL无水乙腈分三次加入反应管并分别蒸干，得到无水18F-。

(2) 亲核反应。冷却反应管至40 ℃，加入3号瓶中溶于0.5 mL无水乙腈的5 mg(6.25 μmol)前体，通入N2混匀后加热至50 ℃，反应5 min。

(3) 水解反应。上述步骤相同，进行三组实验，分别使用三种酸水解中间体，分别是0.4 mL 85% H3PO4、1 mL 12 mol/L HCl和0.5 mL 57% HI，加入后均50 ℃加热10 min。

(4) HPLC分离纯化。水解后加入1 mL 2 mol/L NaOH中和，再加入2 mL流动相溶液稀释，利用HPLC分离，流动相为10%乙腈水溶液，含0.1% 三氟乙酸，流速为4 mL/min，待产品放射性峰出现，收集产品至13号中转瓶(预装50 mL纯水)。

(5) 固相萃取。将液体通过C18萃取小柱至废液，再用20 mL注射用水清洗C18柱并吹干，最后以1.5 mL无水乙醇将18F-DCFPyL淋洗至无菌真空瓶，加入无菌注射用水稀释至乙醇浓度低于10%，得到18F-DCFPyL注射液。

2.2 18F-DCFPyL的质量控制

产品质量控制主要包括性状观察、pH测量、核素鉴定、产品鉴定、放化纯度测量、比活度测量、稳定性测量、内毒素含量检测和有机溶剂残留检测。在铅玻璃后观察注射液性状；以精密pH试纸测量；通过半衰期检测法鉴定核素；以碘铂酸试纸检测法半定量K2.2.2含量；利用分析型HPLC，流动相为18% 乙醇水溶液，含0.2% H3PO4，流速为1 mL/min，紫外波长254 nm，将产品溶液与标准品19F-DCFPyL共进样鉴定产品；放化纯度、比活度和稳定性均通过分析型HPLC测量计算得到；利用快速内毒素检测仪测量内毒素含量；利用气相色谱检测有机溶剂残留。

2.3 18F-DCFPyL的生物安全性评价

取NIH小鼠5只，每只小鼠尾静脉注射0.2 mL的18F-DCFPyL(采用H3PO4水解方法制备，以下实验均相同，比活度为89 GBq/μmol，浓度为555 MBq/mL，载体浓度为5 μg/mL，乙醇浓度为7.5%)，合计放射性为111 MBq/只，载体为50 μg/kg。观察注射后小鼠的反应，并称重；另一组(5只)经尾静脉注射0.2 mL 7.5%乙醇溶液作为对照。饲养、观察1周后称重并处死，解剖，取主要器官做病理检查。

图1 18F-DCFPyL自动化合成模块Fig.1 The module of auto-synthesis for 18F-DCFPyL

图2 18F-DCFPyL的合成路线Fig.2 Radiosynthesis of 18F-DCFPyL

2.4 正常NIH小鼠体内分布实验

取正常NIH雄性小鼠15只，利用随机数字表分为3组，每组5只，18F-DCFPyL产品经注射用水稀释后，经尾静脉每只注射1.85 MBq(0.2 mL，载体为0.083 μg)18F-DCFPyL，分别于注射后30、60、90 min脱颈处死，解剖并取血液、心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉和骨，称重后置于Hidex Automatic Gamma Counter自动计数并衰减校正，计算不同时间点组织的放射性摄取值(%ID/g)。

2.5 临床PET显像

一例前列腺癌术后生化复发患者，为确定下一步治疗方案，需确认是否发生临床复发，并判断属局部复发或区域淋巴结转移或远处转移，拟行18F-DCFPyL PET/CT检查。患者经常规临床评估和实验室检验，并签署知情同意书后，由静脉按3.70 MBq/kg(0.033 μg/kg)注射18F-DCFPyL，静脉注射后60 min行全身PET/CT静态显像[8]。PET图像采用三维采集模式进行全身扫描，采集完成利用CT数据对PET图像进行衰减校正。PET图像重建采用OSEM，CT重建采用标准重建法。以ROI技术勾画感兴趣区域并计算SUVmax。

3 结果与讨论

3.1 18F-DCFPyL的制备

本研究利用PET-MF-2V-IT-I型氟多功能合成模块进行自动化合成，氟化反应以四丁基铵碳酸氢酯为相转移催化剂，可得到较高的亲核效率，而以K2.2.2为相转移催化剂，以K2CO3为碱时氟化效率降低[11]。尽管第一步氟化反应效率较高，但中间体的三个保护基团-叔丁基酯难以水解。本研究对比了三种强酸水解中间体，由于中间体含脲基和酰胺键，高温强酸下易断裂而发生副反应，并且为了避免手性碳发生构型翻转，水解均在温和条件下进行。85% H3PO4、12 mol/L HCl和57% HI均能较好的水解中间体，最后得到的不校正放化产率分别为17.1%、16.9%和18.4%。而在实际应用中，酸液从4号试剂瓶转移至反应管时，由于85% H3PO4粘度较大，较多H3PO4液体残留在试剂瓶、管线和反应管壁而无法进入反应管底参与水解反应，使水解效率下降，若另引入微量(0.1 mL)乙腈清洗试剂瓶，可以较好的解决该问题；浓盐酸粘度低，易于加入反应管，也能较好的水解叔丁基酯，但浓盐酸极易挥发，腐蚀性大，对合成设备的管线和电磁阀体可能造成损害；57% HI常用于制备11CH3I，其加入反应管后，50 ℃加热时可将管壁残留的HI回流至管底，能稳定的水解中间体，在18F-DCFPyL合成完毕，以大量的乙醇清洗反应瓶、管线和反应管，可有效保护设备，因此以HI为水解试剂具有较好的实际应用价值。以10%乙腈水溶液(含0.1% TFA)为流动相，18F-保留时间为3 min，18F-DCFPyL的保留时间为10～12 min，相对应可见紫外吸收峰(图3)。由于未脱保护的中间体脂溶性大，该流动相无法洗脱中间体，若更换纯乙腈可洗脱大量未水解中间体，约为50%～60%(未校正)，可见这三种酸均无法完全水解中间体，若更换强碱水解中间体，会导致副反应的发生，因此，效率更高、副反应少的水解方法仍待进一步研究。

3.2 18F-DCFPyL的质量控制

三种水解方法得到的18F-DCFPyL均进行质量控制。注射液呈无色澄清，pH为5～7，核素半衰期为(112±2) min，产品与标准品共进分析型HPLC，二者相对保留时间一致(图3)，放化纯度大于98%，比活度为54～90 GBq/μmol，产品在4 h后放化纯度仍大于95%，内毒素含量低于5 Eu/mL，乙腈含量低于0.01%，K2.2.2含量低于50 μg/mL，注射液质量符合临床用药标准(依据2015版《中国药典》)。

3.3 18F-DCFPyL的生物安全性评价

注射18F-DCFPyL后NIH小鼠无任何异常表现，1周内无死亡发生，小鼠注射药物前体重为(20.5±2.4) g，一周后体重为(22.8±2.1) g，对照组注射前与注射后一周的体重分别为(20.9±1.7)g和(23.2±2.2)g，其体重变化程度与对照组无差别，主要器官病理切片检查无异常。按千克体重计算，小鼠注射剂量为5.55 GBq/kg，载体剂量为50 μg/kg。正常人检查剂量为370 MBq/65 kg/0.67 mL的18F-DCFPyL，比活度为5.55 MBq/kg，载体剂量为0.05 μg/kg(绝对量为3.25 μg)。此时，小鼠的放射性剂量约为人的注射剂量放射性1 000倍，化学载体近1 000倍，可见该药物安全可靠。

3.4 正常NIH小鼠体内分布实验

18F-DCFPyL在正常NIH小鼠体内分布示于图4。18F-DCFPyL从血中清除很快，30 min摄取值为(1.18±0.12)%ID/g；主要经泌尿系统排泄，肾脏摄取值高，且滞留时间长，直至90 min放射性摄取值仍为(175.52±11.28)%ID/g；药物无法通过血脑屏障，脑内摄取几乎为本底；骨摄取值始终较低，可见18F-DCFPyL在体内稳定性较好，未发生脱氟；在肝、脾和肺组织均有一定的生理性摄取，尤其是脾脏，但均远低于肾的放射性摄取值。可见该探针与68Ga-PSMA-11类似，主要经肾脏代谢，导致泌尿系统高摄取，而膀胱的高摄取将干扰前列腺组织微小病灶的探查。

a——18F-DCFPyL；b——19F-DCFPyL图3 产品分析型HPLC图谱a——18F-DCFPyL；b——19F-DCFPyLFig.3 Analytical HPLC profiles of 18F-DCFPyL and 19F-DCFPyL

图4 18F-DCFPyL在正常NIH小鼠体内分布Fig.4 Biodistribution of 18F-DCFPyL in normal NIH mice

3.5 临床PET显像

注射示踪剂60 min后显像，图5a可见双侧腮腺及颌下腺对称性生理性摄取，甲状腺形态可见，颈部及锁骨上区未见明显异常淋巴结浓聚。肝脏放射性分布大致正常，胰腺形态放射性分布均匀，两侧肾脏显影且密度均匀，腹部可见条

索状肠影，膀胱放射性浓聚，盆腔内多个淋巴结放射性摄取增高，最大者横断面约1.1 cm×0.8 cm，SUVmax为18.4，前列腺癌术后术区未见异常放射性摄取。图5b1 CT可见盆腔内(近右侧附股沟区)长径约0.4 cm小淋巴结，伴放射性摄取值增高，SUVmax为3.6；图5c2 PET图像见骶骨局部放射性浓聚，SUVmax为5.2，但同机CT未见明显骨质密度改变。

前列腺根治性切除术是早期前列腺癌最常用治疗方法，但患者复发比例较大，对于早期生化复发患者，当PSA达到很高水平时，全身骨扫描、CT及MRI才可以发现局部复发或远处转移病灶，对PSA<10 μg/L生化复发患者的应用价值有限。18F-DCFPyL是一个特异性PSMA显像剂，有明确的代谢过程和排泄途径，在其他正常组织中，18F-DCFPyL的分布很少，因此有很好的T/NT(肿瘤组织/非肿瘤组织放射性摄取)值。在PSA还处于较低水平时，18F-DCFPyL PET显像能够早期探测全身是否存在转移灶。Rowe等[7-8]对比了18F-DCFPyL PET显像与传统检查方式CT和99mTc-MDP骨扫描，8例转移性前列腺癌患者通过18F-DCFPyL显像得到138处放射性摄取异常增高区域以及1处疑似增高区域，而CT与骨扫描仅得到30处确定病变区域以及15处疑似病变区域，该研究小组也证实18F-DCFPyL PET显像能够检出Na18F和99mTc-MDP未检出的前列腺癌骨转移病灶。另一方面，在其他高表达PSMA的实体肿瘤中，小肠类癌、透明细胞肾细胞癌和高级别脑胶质瘤的18F-DCFPyL PET检查已见文献报道，同样表现出良好的应用前景[12-14]。

图5 生化复发患者注射18F-DCFPyL 60 min后PET/CT检查结果Fig.5 PET/CT imaging of patient with biochemical recurrence of prostate cancer at 60 minutes after 18F-DCFPyL injection

4 小结

利用国产氟多功能模块，可以实现自动化合成18F-DCFPyL。H3PO4、HCl和HI三种酸的水解效率相近，但高效、稳定的水解方法仍需进一步研究。18F-DCFPyL注射液的质量控制和小鼠安全性评价实验证明该药物安全可靠，符合临床应用要求。18F-DCFPyL在正常小鼠体内经泌尿系统排泄，其余脏器放射性摄取值低。前列腺癌术后生化复发的患者18F-DCFPyL PET显像能够探查同机CT无法检出的微小转移灶。18F-DCFPyL能够更好的早期诊断前列腺癌及探测前列腺癌生化复发患者的病灶。