探讨多巴胺转运蛋白显像剂11C-β-CFT合成效率的影响因素

李海峰，徐仁根，李云钢，陈志军，张晓军，张锦明

(1.江西省肿瘤医院 核医学科，南昌 330029；2.中国人民解放军总医院 核医学科，北京 100853)

PET/CT显像在研究帕金森病(PD)方面有着独特优势，可以对PD患者进行早期鉴别及诊断[1-2]。多巴胺转运蛋白(dopamine transporter, DAT)是控制脑内多巴胺水平的关键因素，间接反映帕金森患者脑内多巴胺的变化[3]，临床上DAT显像剂主要包括：18F-FP-CIT、18F-β-CFT、11C-β-CFT等，18F-FP-CIT存在与5-羟色胺亲和力强，制备工艺较复杂，标记率不高等缺点；18F-β-CFT合成为亲电取代，合成效率较低，产品为有载体等，鉴于这些缺点，其临床应用受到一定限制。11C-甲基-2-β-甲基酯-3-β-(4-F-苯基)托烷(11C-β-CFT)是一种多巴胺转运蛋白PET显像剂，11C-β-CFT与5-羟色胺、去甲肾上腺素受体结合率低，但与DAT高特异性结合，同时此示踪剂受到患者药物因素的干扰较少，已应用于人类神经精神病学方面的疾病诊断与研究[4-5]，如多系统萎缩-P型疾病(MSA-P)、PD的鉴别诊断和研究等[6-7]，同时还应用于动物模型的研究[8-12]等，在临床上有较大的应用前景。临床上证实多巴胺系统的分子变化先于临床表现，可以提早检测到帕金森病的异常表现，提前约10年的时间发现震颤性帕金森等[13]。

目前合成11C-β-CFT常采用11C-CH3-Triflate与去甲基前体(Nor-CFT)在合适的溶剂中甲基化，并经SEP-PAK C18柱色层纯化得到[14]。日常生产11C-β-CFT的过程中，重复性和稳定性较差，反应条件和合成效率之间关系不明确，制备过程中产品收率的影响因素较多，对实现11C-β-CFT自动化、标准化生产造成阻碍。国内文富华等[14]也对11C-β-CFT合成条件进行了研究，其主要集中对气体干燥度、合成碘甲烷温度、使用P2O5柱、Ag-Triflate/C柱使用程度等基础条件进行了优化，本研究在基础条件稳定的基础上[14]，对11C-β-CFT合成效率的影响因素进行进一步的探讨，如溶剂效应、打靶时间控制、产品淋洗条件等，并对这些影响因素进行优化，旨在提高产品收率、稳定生产、提高产品比活度等以满足临床PET/CT检查，对其生产过程中的影响因素进行分析。经优化合成条件，本研究实现了稳定、全自动化制备11C-β-CFT，且保证产品质量满足临床PET/CT需求。

1 仪器与试剂

HM-20回旋加速器：日本住友重机械株式会社；自动化11C多功能合成模块(PET-CM-3H-IT-Ⅰ)：派特(北京)科技有限公司；Endosafe-PTS细菌内毒素快速检测仪：USA Charles River公司；活度计(CRC-15R)：USA Capintec公司；分析型HPLC仪、Sep-Pak C18柱：美国Waters公司；去甲基nor-β-CFT、11C-β-CFT标准品：99.99%,江苏华益科技公司；丙酮、LiAlH4四氢呋喃溶液(1 mol/L)：USA Sigma Aldrich公司；乙腈、二甲基亚砜(DMSO)、57%HI：AR，J&K百灵威公司；HPLC：美国TEDIA公司；无水乙醇：国药集团化学试剂有限有公司。

2 实验方法

2.1 11C-CH3-Triflate的合成[15]

参考文献[15]，使用HM-20加速器经靶内产生11CO2，经自动化11C多功能合成模块LOOP环收集11CO2，通过两次缓慢释放11CO2与0.2 mL 1 mol/L的四氢锂铝(THF)溶液发生反应，生成中间体，反应结束后蒸掉THF，再加入0.3 mL左右HI(57%)，生成的11C-CH3I经氮气带至Triflate炉转化成活性更高的11C-CH3-Triflate。

2.2 11C-β-CFT自动化合成

本研究使用国产碳-11多功能合成模块，合成模块示意图示于图1。由上述产生的11C-CH3-Triflate直接通入到有机溶剂溶解的Nor-CFT中，在室温下进行反应，反应结束后，室温维持1 min；打开V14，将产品转入中转瓶，再打开V19将产品转移至Sep-Pak C18柱进行固相萃取；产品吸附在Sep-Pak C18柱，打开V25，用10 mL水清洗C18柱，再打开V24，用5 mL生理盐水清洗C18柱；最后打开V22，用1 mL无水乙醇将产品洗脱，最后用生理盐水稀释。以上各个程序步骤为计算机控制，全自动化合成完成，全程用时16 min。

2.3 影响11C-β-CFT合成因素

本研究对合成过程中反应溶剂、前体用量、Sep-Pak C18柱残留、轰靶时间等影响因素进行分析，本研究合成效率均以进入反应瓶11C-CH3-Triflate的放射性计数(R3)为基础进行分析。

2.3.1反应溶剂 反应保持11C-β-CFT前体量0.15 mg，反应温度为室温，反应时间1 min不变，选择DMSO、乙腈、丙酮、丙酮和乙腈混合溶剂(1∶1)等不同溶剂各0.2 mL，比较不同溶剂的反应效率。

2.3.2前体用量 不同前体量(0.05～0.35 mg)溶于0.2 mL体积比V(丙酮)∶V(乙腈)=1∶1溶液中，分别与在线产生的11C-CH3-Triflate在室温下反应，比较不同前用体量对合成效率的影响。

2.3.3Sep-Pak C18柱残留 将含粗产品的反应液转移至Sep-Pak C18柱，研究Sep-Pak C18柱富集产品的淋洗条件，以提高产品的合成效率。

2.3.4轰靶时间 保持前体量0.15 mg不变，溶剂为0.2 mL体积比V(丙酮)∶V(乙腈)=1∶1溶液，反应温度为室温，反应时间1 min不变，比较不同的轰靶时间对合成效率的影响。

图1 全自动合成11C-CFT模块Fig.1 The module of auto-synthesis for 11C-CFT

2.4 产品的质量控制

检查产品的澄明度，用pH试纸检测产品pH，使用Endosafe-PTS细菌内毒素快速检测仪检测终产品的热原，按《中国药典》(2015年版)的标准进行细菌检测。利用高效液相测量产品化学纯度、放化纯度和比活度；分析柱为反相Nova-Park C18柱(3.9 mm×150 mm)，流动相为V(乙腈)∶V(0.05 mol/L NaH2PO4水)=15∶85，流速为2.0 mL/min。

3 结果与讨论

3.1 溶剂的影响

在丙酮、乙腈、丙酮∶乙腈(1∶1)、DMSO溶剂中的反应效率分别为：(71.07±2.87)%、(66.07±2.65)%、(80.67±1.53)%、(62.7±2.43)%(n=3,11C-Triflate-CH3校正效率)。可见乙腈、DMSO等溶剂反应效率均低于丙酮∶乙腈(1∶1)溶剂，所以丙酮∶乙腈(1∶1)溶剂更为适合11C-β-CFT的合成；DMSO为高沸点溶剂，可能更适应高温反应。

3.2 前体用量的影响

图2 前体量对收率的影响Fig.2 Effect of the precursor on the synthesis efficiency

0.05～0.35 mg11C-β-CFT前体分别溶于0.2 mL丙酮∶乙腈(1∶1)中，与11C-CH3-Triflate反应，其合成效率分别为：(45.7±2.16)%、(64.76±3.25)%、(79.76±3.59)%、(81.04±3.33)%、(81.34±3.73)%、(85.26±3.25)%、(83.20±3.94)%(n=4)，结果示于图2。当前体量降低到0.1 mg以下，使用量为0.05 mg时合成效率为(45.7±2.16)%，合成效率均低于50%；如果前体量较大时(≥0.25 mg)，产品的合成效率并没有太大的提高，但得到的产品化学纯度会下降，主要是未转化的前体药含量增多。本研究的反应为SN2反应，其反应速率与前体浓度呈正相关，提高前体浓度可提升合成效率。为了保证合成效率、控制产品中前体含量，同时降低合成成本，本研究认为使用0.1～0.2 mg的11C-β-CFT前体为宜。

3.3 轰靶时间的影响

轰靶时间对11C-β-CFT产率有一定的影响，轰靶时间小于18 min时，CO2产量随轰靶时间的增加而迅速上升，但时间过长(超过24 min)，产量有所下降，主要是11C-CO2产生放射性衰减。本研究以0.15 mg前体量溶于0.2 mL丙酮∶乙腈(1∶1)中，随着轰靶时间增加，最终合成产品量在8～24 min间不断的增长并趋于平衡，结果示于图3。11C的半衰期较短，仅有20.4 min，本研究建议轰靶时间应在10～24 min，可以提高产品活度，同时提高产品合成效率。

图3 轰靶时间对收率的影响Fig.3 Effect of the irradiation time on the synthesis efficiency

3.4 洗脱方法的影响

将经15 mL水稀释后的反应液转移到Sep-Pak C18柱上，用8 mL水清洗C18柱，再用1.5 mL乙醇将产品从Sep-Pak C18柱上洗脱，并加注射用水稀释，过无菌滤膜。但C18柱上残留约30%的产品洗脱不下来，可能是C18柱本身的性质所影响，最终使产品收率较低。本研究参照文献[16]在乙醇淋洗产品前，先以10 mL生理盐水处理C18柱，能减少产品洗脱后C18柱上的残留，降低其残留量至7%～12%，可以最终提高产品合成效率。本研究均对C18柱进行正常的预处理、使用，导致C18柱上的残留量较大的原因可能是C18柱对产品11C-β-CFT的吸附性太强，以致难以完全洗脱。推测原因如下：硅胶表面主要以硅氧烷键(-Si-O-Si-)形式存在，硅氧烷键在吸附、富集产品时起到了关键作用；Sep-Pak C18柱是以硅胶基质为主要吸附剂进行固相吸附和富集产品，同时硅胶表面还存在少量未完全反应的硅醇键(-Si-OH)，硅醇键具有较强的反应活性，可以将产品非特异性吸附，吸附后难以淋洗，预先以离子类的缓冲液对C18进行润湿处理，可以避免此类现象；考虑合成的产品用于临床研究，生理盐水是较为合适的选择。11C-Raclopride、11C-β-CFT等均可以非特异性吸附在Sep-Pak C18柱上，本研究先以10 mL生理盐水处理C18柱，能有效减少产品在C18柱上的残留。

3.5 自动化合成及质量控制

优化的11C-β-CFT自动化合成条件为：在自动合成器的反应瓶中将含有0.15 mg的11C-β-CFT前体溶于0.2 mL体积比V(丙酮)/(乙腈)=1∶1溶液中，通入在线转化的11C-CH3-Triflate，室温静置反应1 min。用4 mL水将反应液转移到Sep-Pak C18柱上，经8 mL水淋洗C18柱，10 mL生理盐水预处理C18柱，最后用1.5 mL乙醇洗脱产品，并加生理盐水稀释，过无菌滤膜。最终产品的化学纯度均大于90%，放化纯度大于97%，结果示于图4。

图4 11C-β-CFT化学纯度(a)和11C-β-CFT放化纯度(b)Fig.4 The purity of 11C-β-CFT (a) and the radiochemical purity of 11C-β-CFT (b)

11C-CO2传至LOOP环后，开启合成器的自动程序，从11C-CO2到11C-CH3-Triflate、甲基化反应、纯化至最后得到产品，总计用时16 min。最终产品的外观、pH、HPLC检测放化纯度、化学纯度，细菌内毒素检测，气相色谱仪检测溶剂残留等质量控制结果均符合静脉注射要求，其结果列于表1。

表1 11C-β-CFT的质控结果Table 1 Result of quality control

4 小结

目标产物11C-Raclopride、11C-β-CFT等显像剂均会非特异性吸附在Sep-Pak C18柱上，造成产品产量减少，本研究在淋洗产品前先以极性较大的生理盐水处理C18柱，可有效减少C18柱上的产品残留，并探讨了C18残留产品可能的作用机制；本研究制备产品程序均为计算机控制的全自动化合成，制备过程简单、快捷，且在合成过程中，发现某一步骤出现异常，可立即切换为计算机控制的半自动合成，保证合成成功率，全程耗时缩减在16 min之内。

优化了11C-β-CFT的合成条件：通过对不同的反应溶剂进行比较，选用体积比V(丙酮)∶V(乙腈)=1∶1溶液为反应溶剂；研究了打靶的时间范围，轰靶时间应在10～24 min为宜，提高了产品活度；确定了较为合适的前体用量为0.1～0.2 mg，降低了合成成本，并保证了产品的化学纯度，合成效率稳定提高至(76.93±6.49)%(n=76,11C-Triflate-CH3校正效率)。通过优化合成的11C-β-CFT质量控制结果均符合静脉注射要求。