恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体的构建与鉴定*

赵方　陈鹏　焦剑　胡明道　黄明　刘锋　许晔凯

(昆明医科大学第二附属医院肝胆胰外科一病区, 云南 昆明650101)

肝移植术后的排斥反应是目前肝移植领域面临的一大难题和挑战。在临床上, 术前及术后对于免疫抑制剂的使用多种多样, 但长期用药的经济负担和全身免疫抑制带来的副作用仍给患者带来极大困扰。诱导免疫耐受被认为是解决肝移植排斥反应的理想方案[1-2]。通过基因工程诱导特异性免疫耐受来控制移植后的免疫排斥反应可能是一种可行的方法[3]。TLR4信号传导途径在介导免疫排斥反应中起重要作用[4], 而MyD88作为TLR4信号通路的接头蛋白分子, 在通路信息传递中有关键性作用[5-6]。通过构建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体来抑制MyD88分子的表达, 进而抑制TLR4 / MyD88 / NF-κB通路活化, 则可能降低移植免疫排斥反应。本研究构建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体, 为诱导恒河猴肝移植免疫耐受的后续研究打下基础。

1　材料与方法

1.1实验材料肠杆菌TOP10菌种及293细胞株由中国医学科学院昆明生物学研究所提供, PCR用试剂primer(R&F)由上海吉凯基因公司合成, T4噬菌体DNA连接酶、10XT4噬菌体DNA连接酶缓冲液购自New England Biolabs(NEB)公司, 质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司, Invitrogen Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司, Adeno-XTM纯化试剂盒购自Microbix 公司, BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自HyClone-Pierce 公司, 10×buffer、5×Taq buffer、dNTPs(2.5mM)、Taq polymerase购自Takara公司；羊抗鼠IgG购自Abcan公司；蛋白Marker(10～170kDa)购自Thermo公司。Western细胞裂解液、SDS-PAGE电泳液、Western转膜液、SDS凝胶配置试剂盒、WesternⅠ抗稀释液、WesternⅡ抗稀释液、PMSF、Western封闭液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2×)、millipore显影试剂盒购自碧云天公司。

1.2实验方法

1.2.1恒河猴MyD88RNAi穿梭质粒的构建和鉴定 登陆美国国立生物信息中心(NCBI)查询恒河猴MyD88的碱基序列和mRNA序列: GeneBank序列号为NM-001130681, mRNA: 891bp。针对目的基因序列, 恒河猴MyD88siRNA设计并合成为: GTACAAGGCAATGAAGAAA, 进一步合成恒河猴MyD88RNAi基因片段(双链DNA Oligo)如下：上游: 5′-CCGGAAGTACAAGGCAATGAAGAAACT CGAGTTTCTTCATTGCCTTGTACTTTTTTTG-3′, 下游: 5′TTCATGTTCCGTTACTTCTT TCTCGAGAAAGAAGTAACGGAACATGAAAAAAAC TTAA-3′。然后通过T4噬菌体DNA连接酶将GV119载体酶切后与MyD88siRNA链接后转化CaCl2大肠杆菌TOP10菌种感受态细胞。对长出的阳性克隆进行PCR鉴定(阳性克隆PCR片段大小为 343bp；空载体克隆PCR片段大小为306 bp)；将阳性转化子保存为甘油菌, 各分装200μl进行测序对比。

1.2.2重组腺病毒载体的包装通过coli菌株DH5α扩增腺病毒穿梭质粒和辅助包装载体质粒。培养HEK293细胞, 以含10%FBS的DMEM培养基调整细胞密度在35%左右, 重新接种于T25瓶, 恒温培养箱内培养。24h左右待细胞密度达到50%～60%时即可用于转染。然后混匀穿梭质粒5μg和辅助质粒5μg与DMEM于离心管中, 调整体积为50μl。将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀, 取10μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与50μl DMEM混合, 在室温下温育 5 min后, 与稀释后的 DNA进行混合, 以便形成转染复合物。 将上述混合液转移至 HEK293 细胞的培养液中, 混匀, 置于恒温培养箱中培养。约10～15d后, 待大部分HEK293细胞出现细胞病变(cytopathic effect, CPE), 且有50%的细胞脱壁, 收集细胞重悬于2 ml DMEM中, -70℃/37℃反复冻融、震荡3次, 于4℃ 7000g离心5 min, 收集病毒上清于-70℃保存。

1.2.3恒河猴MyD88腺病毒的扩增和纯化扩增上述所得粗提液获得更多的腺病毒载体, 首先, 稀释HEK293细胞4倍后传入另一个T25细胞培养瓶中, 恒温培养箱中培养。当细胞汇合程度达到60%以上, 吸弃旧培养液, 加入复制缺陷型腺病毒重组成功后收获的粗提液2 ml并孵育90 min, 最后, 补加3 ml DMEM培养液继续培养。大部分细胞出现典型的CPE, 收集细胞并重悬于2ml DMEM中, -70℃/37℃反复冶融、振荡 3 次, 于4℃ 7000 g离心5 min, 收集病毒上清于-70℃保存。重复上述步骤, 完成第二轮扩增。将以上两轮所得的病毒上清液按BD Adeno-X的步骤进行纯化并分装, -70℃保存。

1.2.4重组腺病毒的滴度检测按上述步骤纯化重组腺病毒后感染HEK293细胞, 通过终点稀释方法来算出病毒滴度。病毒滴度计算方法为: 病毒滴度=10(X+0.8)(PFU/mL), X=10-1～10-11依次稀释细胞病变阳性率总和。

1.2.5MyD88蛋白表达的检测前期实验已将恒河猴骨髓血进行分离提纯得到CD34+细胞[7]。将CD34+细胞种入12孔板中, 添加含10%FBS的1640完全培养基, 并加入细胞因子GM-CSF、IL-4(其浓度分别为100ng/ml、50ng/ml), 置于37℃、5%CO2的温箱内培养；将培养至第7d的树突状细胞进行腺病毒的感染, 经腺病毒感染效率检测, 当MOI为500～600时所构建的腺病毒对恒河猴树突状细胞可获得最佳感染效率。感染恒河猴树突状细胞48h后收集树突状细胞总蛋白进行Western blot检测。

2　结果

2.1GV119载体的酶切及鉴定GV119载体质粒经单酶切消化后呈现均一的电泳条带, 此时可与Marker对比判断其分子量大小, 载体酶切产物大小约为 5.5kb, 与预期大小相符合, 见图1A。

2.2MyD88目的基因真核质粒转化感受态细胞结果对照本实验受体细胞为E.coli DH5α菌株, 用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态, 然后与质粒共保温, 实现转化。恒河猴MyD88目的基因真核质粒并带有氨苄青霉素抗性基因, 对于含氨苄青霉素抗生素性质的LB琼脂培养基为阳性反应, 转化组A中的菌落可以存活并分散生长, 说明转化成功。因为没有氨苄青霉素抗性基因, 所以菌落无生长，见表1。虽然对照组C没有氨苄青霉素抗性基因, 但其是处于不含氨苄青霉素抗生素性质的LB琼脂培养基上, 故可生长良好。对照组的结果可以证实在实验过程中排除了除基因以外的其他干扰因素。

表1恒河猴MyD88目的基因真核质粒转化大肠杆菌感受态细胞结果对照

Table1MucacamulattamyD88geneofeukaryoticplasmidtransformedEscherichiacolicompetentcells

　项目转化组A对照组B对照组CLB琼脂培养基抗性++-菌落抗性+--菌落转化结果分散生长无生长成片生长

2.3恒河猴MyD88目的基因与GV119载体连接转化子本实验以少许菌液作为模板进行PCR扩增, 图1B中1为阴性对照, 我们采用最常用的ddH2O, 正常情况下图1B中1 应无任何条带, 若有条带则为假阳性, 可能为试剂被模板污染等。图1B中2为空载体自连对照组, 因载体带的目的基因siRNA较短， 且引物设计在载体上, 所以空载体也有片段。图1B中3为Marker, 自5kb至100bp。图1B中4～8为带有目的基因的质粒载体。电泳分析检测, 可见阳性克隆PCR片段大小约343bp, 空载体克隆PCR片段大小为306bp, 与理论条带大小一致, 见图1B。

2.4恒河猴MyD88RNAi真核质粒阳性克隆测序图及结果分析挑取重组阳性克隆, 接种于含氨苄青霉素LB培养液中过夜培养, 抽提质粒后测序, 测序结果显示前期实验所得恒河猴MyD88-RNAi序列与本实验目的基因测序所得序列一致, 无突变或移码, 进一步确定了PCR扩增产物为我们所要得到的目的基因, 表明成功构建重组干扰质粒。该测序结果图由绿、红、蓝和黑色测序峰组成, 代表不同的碱基序列。该图中峰型正常, 未见异常杂带, 见图1C。

2.5腺病毒滴度观察情况 将重组穿梭质粒MyD88siRNA和骨架质粒在HEK293细胞中共转染, 48 h后在荧光显微镜下见HEK293细胞中有绿色荧光蛋白表达, 直到病毒稀释至10-11时与空白对照对比不明显, 可计算样品腺病毒滴度大致为2.0E+10pfu/ml, 见图2。

2.6MyD88siRNA对MyD88蛋白表达作用在image quent成像系统下进行曝光, 可见33kD处出现特异性条带, 在43kD处可见β-actin内参成功表达, 干扰组MyD88蛋白的表达明显降低, 可推断MyD88siRNA对树突状细胞中的MyD88蛋白表达具有抑制作用, 见图1D。

图1　恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体的鉴定Figure1　Identification of adenovirus vector of mucaca mulatta myD88 gene silencing

注: A.GV119载体, Age I/ EcoR I酶切电泳图; B.恒河猴MyD88-RNAi转化子电泳图； C.恒河猴MyD88-RNAi测序图； D.western blot鉴定MyD88在imDC中的表达

图2　腺病毒滴度观察Figure 2　Adenovirus titer observation

注: a、b、c、d、e、f分别是稀释病毒原液至10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11时荧光显微镜下观察的情况(×100), g是空白对照

3　讨论

目前国内外啮齿类动物尤其小鼠关于腺病毒载体构建及诱导免疫耐受的报道较多, 相关结果却多缺乏临床应用价值, 究其原因在于啮齿类动物在基因相似度上和人吻合度高, 但免疫系统和人类却有较大差异, 因此采用和人类高度相似非人灵长类实验动物恒河猴进行免疫相关研究有重要意义。目前恒河猴免疫相关基因的转染病毒载体构建报道少见, 本研究构建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体, 为下一步用于诱导恒河猴肝移植免疫耐受奠定基础, 具有重要的应用价值。

腺病毒载体是目前基因工程中广泛使用的病毒载体之一, 腺病毒载体的转基因效率较高, 体外实验的转导效率通常接近100%；而且可以对不同类型的人组织细胞进行转导, 不会受到靶细胞是否为分裂细胞所限制；能够比较容易得到高滴度病毒载体, 在细胞培养物中重组病毒滴度可达(10E+11)/ml；其进入细胞后并不整合到宿主细胞基因组, 快速表达, 安全性较高[8-9]。在基因治疗临床试验方面腺病毒载体已经得到了越来越多的应用, 成为继逆转录病毒载体之后最具前景的病毒载体[10-11]。而且腺病毒载体也被广泛用于RNAi中[12], 这也是本实验采用腺病毒作为载体的原因之一。

MyD88是TLR信号通路的重要信号成员, 在该通路的信号转导中发挥着重要作用[13-14]。基于此观点, 在本实验中我们将MyD88作为研究靶点, 应用RNA干扰技术特异性抑制MyD88的表达以期达到在末端MyD88水平阻断TLR信号通路的目的。

通过前期试验工作筛选得到有效恒河猴MyD88RNAi真核质粒载体, 而后进行设计合成。在恒河猴MyD88siRNA腺病毒载体的制备过程中, 菌落PCR电泳分析检测, 可见扩增产物出现特异性条带, 阳性克隆PCR片段大小与理论值相符合。随后的阳性克隆测序中, 测序结果显示前期实验所得恒河猴MyD88-RNAi序列与本实验目的基因测序所得序列一致, 无突变或移码, 进一步确定了PCR扩增产物为我们预期目的基因一致, 表明成功构建重组干扰质粒。最后将恒河猴DC经MyD88siRNA腺病毒载体感染48h后, 进行WB检测, 结果显示干扰组蛋白表达降低, 由此可推断MyD88siRNA对恒河猴树突状细胞中的MyD88蛋白表达具有抑制作用。实验后续采用MyD88siRNA腺病毒载体感染恒河猴imDC, 从而体外实验观察其对恒河猴imDC生物学特性的影响, 为临床肝移植提供了一个新的治疗途径。

4　结论

本实验结果显示, 成功构建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体,MyD88siRNA对恒河猴树突状细胞中的MyD88蛋白表达具有抑制作用, 为研究肝移植免疫耐受提供了基础路径。 此实验使用的是与人类基因排列高度相似的非人灵长类实验动物恒河猴, 较其他实验动物有较大的优越性。恒河猴生理上与人类接近, 是较理想的肝移植免疫耐受模型的实验动物[15-18], 目前国内外有关牛、绵羊、禽类尤其是小鼠关于腺病毒载体构建及诱导免疫耐受的报道较多, 但是恒河猴MyD88 siRNA腺病毒载体构建并用于诱导恒河猴肝移植免疫耐受的研究报道相当少见[19-21], 因此, 构建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体为诱导恒河猴肝移植免疫耐受奠定了重要基础。