MicroRNA-1469低表达与食管鳞状细胞癌临床病理特征及预后的关系

李亚俊，顾晓静，杨乐，边虹

（宁夏医科大学总医院 1.消化内科，2.胸外科，宁夏 银川 750004）

食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）是一种常见的消化道肿瘤，在我国的发病率较高[1]。由于其具有局部侵袭浸润、早期转移等特点，往往预后不佳，生存率较低。通过对ESCC生物学标志物及信号通路的研究，可以预测肿瘤的预后，指导治疗方案，实现精准治疗，从而提高ESCC的生存率。

微小RNA（microRNA）是一类非编码功能的单链RNA，长度约17～25个核苷酸。microRNA参与包括细胞增殖、凋亡、迁移及分化等多种病理生理过程，并且参与肿瘤信号通路，在肿瘤的发生、发展中具有重要作用[2]。MicroRNA-1469（miR-1469）系microRNA家族中的一员，位于15号染色体，相关研究发现[3]，miR-1469在多种肿瘤组织中异常表达，具体表现为在凋亡的肿瘤细胞中，miR-1469的表达水平显著提高。目前已有文献报道microRNA在ESCC中的作用[4]，但miR-1469与ESCC的关系尚无相关报道。本研究选择miR-1469，首先研究其在ESCC中的表达情况，并观察其在ESCC进展及预后中所起到的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2009年6月-2010年6月在宁夏医科大学总医院初次诊断为ESCC的患者98例。入选标准为：①均行食管癌根治手术；②术前未行放化疗；③未有围手术期死亡；④临床病理与随访资料完整。所有的肿瘤组织及肿瘤旁正常食管组织于术后储存于液氮中，病理结果经病理科两名医生确认。TNM分期采用UICC/AJCC 2009第7版标准。

所有患者随访内容包括体格检查、上消化道造影、胸腹部CT以及胃镜等，随访间隔时间为3～6个月，随访时间至患者死亡或本研究的截止日期（2015年6月）。

1.2 实时荧光定量聚合酶链反应

根据说明书使用Trizol裂解液从冷冻组织中提起总RNA，然后通过U-3010紫外分光光度计测定RNA的浓度及纯度。然后依据上海生工RNA PCR-Kit试剂说明书进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测基因表达水平。采用IQ5 software分析实验结果，计算Ct值。使用内参基因GAPDH的Ct值校正目的基因Ct值，得到△Ct值。比较处理组和对照组的△Ct值得到△△Ct值。基因表达量比值（处理组/对照组）=2-△△Ct。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料以例表示，比较用χ2检验，Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，Log-rank检验生存曲线的统计学差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-1469在ESCC中的表达情况

比较miR-1469在ESCC及癌旁正常组织中的表达情况，如果ESCC中的miR-1469的表达量低于癌旁正常组织，系miR-1469的低表达，反之，为miR-1469的高表达。结果显示（见图1），miR-1469低表达组共42例，表达量为（2.51±0.73），miR-1469高表达组共56例，表达量为（6.27±1.08），两组比较差异有统计学意义（t=-19.457，P=0.000）。

图1 miR-1469在ESCC中的表达

2.2 miR-1469表达与临床病理特征的关系

miR-1469表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结的转移及病理分期，差异有统计学意义（χ2=8.704、24.000和53.844，P=0.033、0.000和0.000），而与年龄、性别、肿瘤直径和分化程度，差异无统计学意义（χ2=0.056、1.224、2.046和5.125，P=0.813、0.269、0.193和0.076）。见附表。

2.3 miR-1469表达与肿瘤复发和转移的关系

共有65例患者出现肿瘤的复发或转移，其5年无瘤生存率为32.6%，其中38例为miR-1469低表达，27例为miR-1469高表达，两组比较差异有统计学意义（χ2=7.040，P=0.008），提示miR-1469低表达组的肿瘤复发或转移率高于高表达组。低表达miR-1469的患者5年无瘤生存率低于高表达miR-1469的患者（17.9% vs 42.8%，P=0.004）。见图2。

附表 miR-1469的表达与临床病理特征的关系 例

图2 患者5年总无瘤生存率

2.4 miR-1469的表达与淋巴结转移的关系

分析miR-1469的表达与淋巴结转移的关系发现，在N0患者中，miR-1469低表达者共9例，在N1～3患者中，miR-1469低表达者共33例，两者差异有统计学意义（χ2=24.000，P=0.000）。在N1～3的患者中，低表达miR-1469组的5年无瘤生存率低于高表达组（7.3% vs 31.5%，P=0.043）。见图3。

2.5 miR-1469的表达与预后的关系

在98例患者中，56例在随访期间内死亡，5年总生存率为39.5%。低表达miR-1469组的5年总生存率低于高表达组（29.3% vs 47.1%，P=0.027）。见图4。

图3 N0及N1～3患者的5年无瘤生存率

图4 患者5年总生存率

3 讨论

作为一种常见的消化道恶性肿瘤，食管癌具有较高的死亡率，多数患者在发现的时候肿瘤就已经侵透食管外膜或已经发生远处转移，并且预后不佳[5]。目前国际上通用的分期标准为TNM分期，根据此分期来判断患者的病程及预后，但是TNM分期能不能准确地判断病情的转归尚存在争议，越来越多的研究关注于淋巴结转移的个数[6]。在ESCC患者中，淋巴结转移者更容易出现肿瘤的复发及转移，更多的学者认为淋巴结转移系独立的预后因素[7]。microRNA富含RNA，其序列大小约为17～25个核苷酸，在调节细胞增殖、凋亡、迁移和分化等生理及病理过程中起到了关键的作用[8]，并且参与肿瘤信号通路的过度激活或者过度抑制，在肿瘤的临床诊疗中，能够指导分型及预后[9]。作为microRNA中的一员，miR-1469位于15号染色体，具有致癌基因或抑癌基因的活性[10]，参与了肿瘤的进程中。miR-1469在肿瘤组织中异常表达，具体表现为在凋亡瘤细胞中，miR-1469的表达水平提高。XU等[3]的研究发现，在肺癌中，miR-1469能够增强VP16所诱导的细胞凋亡，进一步研究发现stat5a系miR-1469作用的靶点，miR-1469通过stat5a调节肿瘤细胞的增生和凋亡。关于stat与食管癌的关系已有大量的文献阐述，而miR-1469、stat5a及食管癌3者之间的关系尚未有相关研究。因此，本研究选择miR-1469，首先研究其在ESCC中的表达情况，并观察其在ESCC进展及预后中所起到的作用。本研究系统分析98例ESCC患者标本中miR-1469的表达以及与临床病理特征及预后的关系，发现miR-1469的表达水平与浸润深度、淋巴结转移及病理分期差异有统计学意义，具体表现为在T1、N0及Ⅰ期患者中，miR-1469多呈现高表达，在中晚期患者中多为低表达，这提示miR-1469的表达水平与ESCC的进程密切相关，miR-1469的表达水平能够协助判断肿瘤的分期及淋巴结转移情况。

miR-1469的表达水平与5年无瘤生存率和总生存率密切相关，低表达miR-1469的ESCC患者，其5年无瘤生存率和总生存率均低于高表达者。进一步地分析发现，在N0患者中，miR-1469表达水平的高低与5年无瘤生存率无相关，但在N1～3患者中，其5年无瘤生存率差异有统计学意义，这提示在淋巴结转移的患者中，miR-1469低表达者更容易出现肿瘤的复发及转移。

综上所述，miR-1469的表达与ESCC的病理分期及预后具有密切的关系，miR-1469低表达患者更容易出现ESCC的复发及转移，且预后较差，与既往的文献[3]关于miR-1469对于人类肿瘤的抑制作用的报道具有一致性。但是miR-1469对ESCC的抑制作用需要进一步的体外细胞实验加以验证，其作用靶点及信号通路需进一步明确。这将对于实现ESCC的精准治疗具有重大的意义。