自体胰岛细胞移植治疗大鼠全胰十二指肠切除术后糖尿病的研究

郭栋，刘全达，刘国涛，于永红，叶进冬，叶华虎，王启伟

（1.锦州医科大学火箭军总医院研究生培养基地，辽宁 锦州 121001；2.中国人民解放军火箭军总医院 肝胆外科，北京 100088；3.中国人民解放军军事医学科学院，北京 100850）

目前，欧美部分医院利用全胰腺切除联合自体胰岛细胞移植治疗慢性胰腺炎已经非常成熟[1-4]，在胰岛细胞移植的途径上通过门静脉移植普遍优于其他移植部位[5-6]。而国内临床利用此手术方式治疗慢性胰腺炎的案例较少[7]。本实验利用大鼠全胰十二指肠切除术复制糖尿病模型，模拟临床自体胰岛细胞移植治疗大鼠糖尿病，为其正式应用于临床提供实验研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄SD雄性大鼠30只购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心（生产许可证号：SCXX-军）。实验室光照为12 h昼夜交替，动物的饲养环境温度控制在25～28℃，相对湿度为45%～60%，自由进水及摄食。

1.2 实验试剂和仪器

胶原酶XI、平衡盐溶液、双硫腙DTZ、Ficoll 400、RPMI 1640培养基、台盼蓝（均购自美国Sigma公司），血糖仪（瑞士罗氏公司），ELISA试剂盒（天津德普DPC公司），糖化血红蛋白仪（美国Primus公司），超净台（美国Sigma公司），低温离心机（美国Sigma公司），显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 方法

1.3.1 实验分组 将8周龄SD雄性大鼠随机分成对照组、手术组和实验组，每组10只。对照组未作任何手术及药物处理，手术组行全胰十二指肠切除术，实验组行全胰十二指肠切除联合自体胰岛细胞移植术。

1.3.2 模型复制 糖尿病大鼠模型复制方式借鉴LEE氏法[8-11]，选取8周龄SD雄性大鼠，禁食水24 h。10%的水合氯醛8 ml行腹腔注射麻醉并备皮，固定大鼠后75%酒精腹部消毒。大鼠腹部正中约10 cm切口，探查胰腺被胃十二指肠、横结肠及脾脏包绕，眼科镊提起胃脾及横结肠，离断周围韧带充分游离胰腺及周围脏器。分离胰腺组织与横结肠系膜直至暴露门静脉及脾静脉根部，分离胰腺组织与门静脉黏合部，结扎胰十二指肠动静脉及脾静脉。按缺血线离断十二指肠（见图1）。远端十二指肠做荷包缝合进行闭合，于近端空肠做侧面切口为吻合口。丝线肠道间断缝合做肠道吻合。于吻合口远端1 cm处做小切口，将提前放置胆道的硅胶管放入十二指肠做胆肠吻合，用7-0丝线将胆道周围结缔组织与十二指肠浆膜缝合。

1.3.3 胰岛分离纯化 将胰腺完整从标本剪下（所有过程均在冰上操作，降低胰腺组织新陈代谢），平衡盐溶液清洗后加入青霉素、胎牛血清及1640培养基，无菌眼科剪尽可能剪碎胰腺。将灌洗好的胰腺碎片组织加入2 ml浓度为1 mg/ml胶原酶XI，放置在38℃的水浴中消化25 min，肉眼下未见到成块的胰腺组织，加入4℃的平衡盐溶液终止消化[12-13]。离心机4℃下1 000 r/min离心2 min，弃去上清液，洗涤2次后1 000 r/min离心3 min，弃上清液。纯化采用传统的密度梯度离心法[14-17]，将4 ml浓度为25%的Ficoll 400溶液（25 g Ficoll 400加入100 ml平衡盐溶液）与沉淀组织进行混匀，然后逐层加入2 ml浓度为23.0%、20.5%、11.0%的Ficoll 400，以2 000 r/min速度离心15 min，离心结束后取20.5%～23.0%及20.5%～11.0%颗粒介质为纯化的胰岛。加入青霉素、胎牛血清及1640培养基0.5 ml混悬胰岛。

图1 全胰十二指肠切除

1.3.4 胰岛计数 以双硫腙对胰岛细胞进行特异性染色，显微镜下胰岛细胞染成猩红色，非胰岛细胞不着色，胰岛细胞直径＞150 μm为1个胰岛当量（islet equivalent quantity, IEQ）[18]。胰岛细胞纯度（%）=（双硫腙染色阳性细胞数/细胞总数）×100%[19]。

1.3.5 胰岛回输 用1 ml注射器抽取纯化好的胰岛细胞混悬液，以3 ml/min匀速注入大鼠肠系膜上静脉中，使最终定植入肝脏，注射完毕后棉签按压穿刺点5 min。

1.3.6 血糖、C肽、糖化血红蛋白监测 术后大鼠随机血糖≥16.7 mmol/L，出现多饮、多尿、多食、体重下降等糖尿病症状即模型复制成功[20-21]。术后各组血糖连续监测15d，实验组每周监测2次，连续4个月。术后各组糖化血红蛋白连续监测4个月（每个月监测1次）。实验组在术后15d进行高糖刺激，分别监测刺激前、后的血糖和C肽变化。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组多时间比较采用重复测量设计的方差分析，组间比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖尿病模型的可靠性

3组大鼠术后6 h～15 d的血糖变化比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的血糖有差异（F=8.650，P=0.000）；②3组的血糖有差异（F=125.995，P=0.000），实验组和对照组血糖浓度较手术组低，实验组胰岛移植后血糖控制较好；③3组的血糖变化趋势有差异（F=1119.277，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，实验组大鼠血糖浓度与手术组大鼠血糖浓度差异有统计学意义（P＜0.05），而与空白组大鼠血糖比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

对手术组的大鼠血糖进行监测，第5天手术组大鼠血糖（24.30±2.51）mmol/L与对照组大鼠血糖（4.94±0.39）mmol/L比较，差异有统计学意义（t=-17.008，P=0.000）。第10天手术组大鼠血糖（25.48±1.37）mmol/L与对照组大鼠血糖（5.10±0.29）mmol/L比较，差异有统计学意义（t=-32.370，P=0.000）。从连续的血糖监测发现，大鼠的血糖水平保持持续高值状态（见图2），且在术后日常观察中发现大鼠有饮水量、尿量明显增多等症状。因此，本研究通过全胰十二指肠切除术复制大鼠糖尿病模型成功。

表1 3组大鼠不同时间点的血糖浓度比较 （n =10，mmol/L，±s）

表1 3组大鼠不同时间点的血糖浓度比较 （n =10，mmol/L，±s）

组别 术后6 h术后1 d术后2 d术后3 d术后4 d术后5 d术后6 d术后7 d术后10 d术后13 d术后15 d对照组4.81±0.374.72±0.344.96±0.464.84±0.305.06±0.454.94±0.395.02±0.334.94±0.425.10±0.295.14±0.195.18±0.37手术组9.28±1.87 20.58±2.00 22.20±2.60 24.70±1.04 24.60±1.35 24.30±2.51 23.22±1.51 24.24±2.19 25.48±1.37 25.88±0.86 25.72±1.18实验组8.95±0.88 12.85±0.578.62±0.697.01±0.854.98±0.445.11±0.235.11±0.215.04±0.245.03±0.265.06±0.345.14±0.30

图2 术后血糖变化趋势比较

2.2 自体胰岛细胞移植后的血糖变化

自体胰岛细胞移植术后第1天，实验组与手术组血糖水平比较，差异有统计学意义（t=8.154，P=0.000），实验组下降（见图2）；实验组大鼠随机血糖浓度＜11mmol/L可持续至术后4个月。

3组大鼠术后4个月的血清糖化血红蛋白比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的血清糖化血红蛋白有差异（F=4.857，P=0.025）；②3组的血清糖化血红蛋白有差异（F=7.858，P=0.000），实验组和对照组血糖浓度较手术组低，实验组胰岛移植后血糖控制较好；③3组血清糖化血红蛋白变化趋势有差异（F=2287.632，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，实验组大鼠血糖浓度与手术组大鼠血糖浓度差异有统计学意义（P＜0.05），而与空白组大鼠血糖比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

持续4个月监测3组大鼠血清糖化血红蛋白，第4个月手术组与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），手术组升高；实验组血清糖化血红蛋白水平维持在（5.28±0.19）%，与对照组血清糖化血红蛋白水平（5.23±0.28）%比较，差异无统计学意义（t=-1.114，P=0.298），而与手术组血清糖化血红蛋白（14.70±1.01）%比较，差异有统计学意义（t=-20.978，P=0.000）。见图3。

表2 3组大鼠不同时间点的血清糖化血红蛋白比较（n=10，%，±s）

表2 3组大鼠不同时间点的血清糖化血红蛋白比较（n=10，%，±s）

组别 术后1个月 术后2个月 术后3个月 术后4个月对照组5.10±0.305.22±0.564.98±0.635.23±0.28手术组12.96±1.6513.20±2.5613.54±3.7514.07±4.10实验组5.24±0.435.01±0.515.30±0.115.28±0.19

图3 术后糖化血红蛋白水平比较

2.3 自体胰岛细胞的活性

分离纯化后的胰岛细胞呈类圆形（见图4A）；双硫腙染色后胰岛细胞呈猩红色（见图4B）；台盼蓝染色后胰岛细胞未着色，胰岛细胞团结构完整（见图4C、D）；胰岛细胞纯度＞95%。

全胰十二指肠切除联合自体胰岛细胞移植术后15d，对实验组大鼠进行高糖刺激，刺激后大鼠血糖水平（实验前5.28±0.30mmol/L、实验后10min 7.74±0.65mmol/L）未出现明显波动；刺激后血清C肽水平（实验前0.23±0.02ng/ml、实验后10 min 0.71±0.07ng/ml）成倍升高。

图4 各状态下的胰岛

3 讨论

自1977年明尼苏达大学医学院首用全胰切除联合自体胰岛细胞移植术以来，国外多数医院已成功地将此技术应用于临床[22-24]。而国内临床自体胰岛细胞移植术的应用报道不足，某些疾病如慢性胰腺炎手术切除全胰腺后导致糖尿病治疗基本依赖皮下注射胰岛素[25]。自体胰岛细胞移植术后可以更加精确地控制血糖，不仅可以有效降低血糖，而且可以较长时间稳定的控制血糖，防止因血糖的不稳定性导致术后并发症的发生，对提高慢性胰腺炎等疾病患者术后的生活质量有显著效果[26-27]。

本研究结果表明，大鼠全胰十二指肠切除术后，血糖在术后第1天即出现明显升高，并且在持续15d的血糖监测中均表现出高血糖状态，同时伴有多饮、多尿等糖尿病症状，表明全胰十二指肠切除术复制糖尿病模型安全可靠。目前国内外对手术切除全胰腺复制大鼠糖尿病模型描述较少，本次实验为复制大鼠糖尿病模型提供新方法，同时为自体胰岛细胞移植的长期大量研究提供实验基础。

自体胰岛细胞移植术后实验组大鼠血糖与手术组大鼠血糖相比下降明显，并且维持正常稳定状态持续4个月，表明移植后胰岛功能良好。术后出现的短暂血糖升高，考虑移植的自体胰岛处于功能恢复期，胰岛移植2～3 d后血糖逐步平稳。自体胰岛移植术后，实验组的糖化血红蛋白与对照组差异无统计学意义，表明自体胰岛移植后血糖控制良好。术后15 d对实验组大鼠进行静脉高糖刺激，发现刺激后10 min检测的血清C肽较刺激前成倍增长，说明自体胰岛移植后胰岛细胞的活性良好。胰岛细胞移植入肝脏后依然持续稳定发挥功能，与解剖关系、血供、胚胎学有较大关联。解剖学上，胰腺组织与肝脏门静脉毗邻密切，胰岛β细胞可以通过毗邻的门静脉系统可以及时密切监测并控制血糖，因此经门静脉移植入肝脏后，同样可以密切监测血糖变化。血供方面，由于胰腺胰岛属于高耗氧组织，而植入门静脉系统后也同样可以汲取门静脉血液中的氧分子。胚胎学方面，自体胰岛细胞虽然没有排斥反应的发生，但是细胞环境的变化也会给细胞生存带来或多或少的影响，而从本研究监测大鼠血糖及糖化血红蛋白的结果，甚至术后一定时间进行的高糖刺激分析，自体胰岛细胞功能较为稳定且持久，可能和肝脏、胰腺在胚胎期同源于内胚层有一定的关联。

全胰十二指肠切除后自体胰岛细胞移植术治疗大鼠糖尿病效果较好，但本实验使用样本数量较少，其结论仍需大量样本加以论证。