石菖蒲醇提物对SH-SY5Y细胞增殖及抗氧化损伤作用*

★ 魏飞亭　董嘉皓　唐怡　李斐　陈洋　陈海芳　杨武亮　袁金斌*（江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004）

阿尔茨海默病，又称老年痴呆，是一种神经退行性疾病，临床表现为记忆功能下降，日常生活自理能力减退，并伴有各种神经精神症状和行为障碍。目前此疾病的发病机制尚未明确，但是过度的氧化应激损伤被认为是其重要的原因之一［1］。H2O2是体内氧化代谢的中间产物，极易通过细胞膜进入细胞，产生高活性的自由基，进而损伤细胞器，导致细胞功能障碍，而神经细胞的过氧化氢酶活性低，使其比其他类细胞更容易受到氧化损伤［2］。人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞，来源于1970年建立的SH-N-SH细胞系经三次克隆后的亚系。其形态、生理及生化功能与正常神经细胞相似，作为拟神经细胞模型，被广泛用于神经退行性疾病的研究中［3］。

石菖蒲为天南星科植物石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）的干燥根茎［4］，具有镇静、抗抑郁、神经保护等作用于神经系统的药理活性［5］，其在神经系统性疾病的防治中具有广泛的应用前景。现阶段对石菖蒲的神经系统药理作用的研究中，大多以挥发油和水提物为研究对象［6-8］，而对醇提物鲜有提及。本文以石菖蒲醇提物为研究对象，用H2O2诱导SH-SY5Y细胞建立氧化应激损伤模型，探讨石菖蒲醇提物对SH-SY5Y细胞增殖的影响和对H2O2引起的细胞损伤的保护作用，为石菖蒲用于氧化应激相关的神经退行性疾病的治疗及研究提供理论依据。

1　实验材料

1.1药材与试剂 石菖蒲药材采自于江西南昌，经江西中医药大学舒积成副教授鉴定为天南星科植物石菖蒲Acori tatarinowii Schott的干燥根茎。DMEM/F12（1∶1）培养基、牛胎血清、青霉素-链霉素（美国GIBCO公司）；0.25%胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）（北京索莱宝科技有限公司）；30 %过氧化氢（西陇化工股份有限公司）；0.22μm微孔滤膜（广州洁特生物过滤股份有限公司）。

1.2仪器 CO2细胞培养箱（美国Thermo Fisher公司）；SIGMA3-18K高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；XDS-1B倒置相差显微镜（日本Nikon公司）；ELx800紫外可见光酶标仪（美国BioTek公司）；96孔板（美国Corning公司）。

1.3细胞 SH-SY5Y细胞，购自中科院上海细胞库。SH-SY5Y细胞培养于含10 %灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12（1∶1）培养液中。于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至铺满培养基底部70%～80%时，用0.25%胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

2　方法

2.1药液的配置 石菖蒲药材净制，放入60℃烘箱，烘2h，粉碎，称取约50g（过二号筛），置于1000mL圆底烧瓶中加入500mL 70%乙醇，回流2h，趁热抽滤，药渣再重复提取2次，合并滤液，浓缩，将浓缩液置于-80℃中冷冻12h，制成冻干粉，再精密称取石菖蒲冻干粉适量，用培养基配制成含药培养基，过0.22μm滤膜，于4℃避光保存，备用。

2.2不同浓度石菖蒲培养基对细胞增殖的影响 取对数生长期的SH-SY5Y细胞，制成浓度为1×104个/mL的细胞液，接种至96孔板，每孔200μL，培养24h后，小心吸弃培养液。设置石菖蒲组、对照组和调零组。石菖蒲组加入200μL不同浓度的含药培养基（0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00g/L，同一浓度设置6个复孔）；对照组常规加入等量培养基，不含石菖蒲醇提物；调零组加入终体积的培养基，不含细胞和石菖蒲醇提物。培养24h后，每孔加入20μL的MTT，37℃避光孵育4 h，小心吸弃培养液，加入100μL DMSO，震荡，用酶标仪于490 nm处测定吸光度值（A），计算细胞存活率。

2.3H2O2诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型的建立 取对数生长期的SH-SY5Y细胞，制成浓度为1×104个/mL的细胞液，接种至96孔板，每孔200 μL，培养24h后，小心吸弃培养液。设置模型组、对照组和调零组。模型组［9］加入H2O2致终浓度为200μmol/L；对照组用等量的空白培养基代替H2O2溶液；调零组加入终体积的培养基，不含细胞和H2O2。培养24h后，每孔加入20μL的MTT，37℃避光孵育4h，小心吸弃培养液，加入100μL DMSO，震荡，用酶标仪于490 nm处测定吸光度值（A），计算细胞存活率。

2.4石菖蒲培养基对H2O2引起的SH-SY5Y损伤的保护作用 取对数生长期的SH-SY5Y细胞，制成浓度为1×104个/mL的细胞液，接种至96孔板，每孔200μL，培养24h后，小心吸弃培养液，并设置保护组、对照组、模型组和调零组。保护组加入200μL不同浓度的石菖蒲醇提物（0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00g/L，同一浓度设置6个复孔）；对照组和模型组用等量的空白培养基代替含药培养基溶液；调零组加入终体积的培养基，不含细胞和石菖蒲醇提物。培养24h后，实验组和模型组加入H2O2致终浓度为200μmol/L，对照组和调零组加入等体积的空白培养基，继续培养24h后，每孔加入20μL MTT，37℃避光孵育4h，小心吸弃培养液，加入100μL DMSO，震荡，用酶标仪于490nm处测定吸光度值（A），计算细胞存活率。

2.5数据处理及统计方法 细胞存活率计算方法如下（A实验为石菖蒲组、模型组或保护组的吸光度）。使用分析软件（Graphpad Prism 5.0）对各样品数据进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01有统计学意义。

细胞存活率=（A实验-A调零）/（A对照-A调零）×100%

3　结果

3.1不同浓度的石菖蒲醇提物作用于SH-SY5Y细胞后的细胞存活率 与对照组相比较，SH-SY5Y细胞经不同浓度石菖蒲醇提物作用24h后，0.25g/L和0.50g/L组细胞数目增多，突触增加，贴壁功能和折光性上升，其余组分细胞形态未有明显改变。见图1。根据吸光度计算细胞存活率，并对数据进行分析测算发现，药物的各个浓度对细胞增殖的影响不同，见图2。当石菖蒲醇提物浓度为0.25g/L和0.50g/L时，其对细胞增殖有显著的促进作用（P＜0.01），而其他浓度下的药物均无显著促进作用或抑制作用（P＞0.05）。

图1　不同浓度石菖蒲醇提物对SH-SY5Y细胞形态的影响

图2　不同浓度石菖蒲醇提物对细胞存活率的影响

3.2石菖蒲培养基对H2O2引起的SH-SY5Y损伤的保护作用 与对照组相比，H2O2模型组细胞密度降低，突触消失，胞膜破裂，细胞皱缩，细胞间隙增大。而预先加入不同浓度石菖蒲醇提物培育24h后再加H2O2的组分，其细胞形态与模型组相比较，损伤程度较轻微，细胞密度也较大，见图3。

图3　不同浓度石菖蒲醇提物对H2O2损伤的SH-SY5Y细胞形态的影响

各组分用MTT法检测细胞存活率，并对数据进行分析测算，结果见图4，由图可知，与对照组相比，H2O2模型组SH-SY5Y细胞存活率明显降低（P＜0.01），表明成功构建细胞损伤模型；与模型组相比，0.25g/L和0.50g/L的石菖蒲培养基组细胞存活率显著提高（P＜0.01），表明0.25g/L和0.50g/L的石菖蒲培养基可对H2O2引起的细胞损伤起保护作用，且0.25g/L浓度下抗损伤效果最强。

图4　不同浓度石菖蒲醇提物对H2O2损伤的SH-SY5Y细胞存活率的影响

4　讨论

氧化应激是指机体在受到有害刺激的情况下，产生过多的活性氧自由基和活性氮自由基，使体内氧化和抗氧化系统失衡，导致细胞死亡和组织受损［1］。而H2O2是人体内重要的活性氧自由基之一，能够与多种生物靶标分子反应，诱导细胞发生氧化损伤［2］。本实验以H2O2体外培养SH-SY5Y细胞，建立氧化损伤模型。用MTT法和倒置相差显微镜评价细胞的存活和繁殖情况，同时考察了不同浓度石菖蒲醇提物对正常SH-SY5Y细胞增殖的影响和对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用。

发现当加入200μL浓度分别为0.25g/L和0.50g/L的石菖蒲醇提物培养基时，与对照组和模型组相比细胞的存活率均显著升高（P＜0.01），而其他浓度的石菖蒲醇提物组并无显著性促进、抑制或抗氧化损伤作用。表明石菖蒲醇提物在一定浓度下对SH-SY5Y细胞的生长有促进作用，且对H2O2诱导SH-SY5Y细胞的氧化损伤具有保护作用，即石菖蒲醇提物对于氧化应激相关的神经退行性疾病可能具有治疗作用。