紫外分光光度法测定鸭脚通颗粒中总黄酮的含量

★ 易徐航　张钰琪　袁娟丽（萍乡市食品药品检验所 江西 萍乡 337000）

鸭脚通颗粒为萍乡市中医院的医院制剂，具有益气补虚之功效，用于尿路结石的治疗。本品为银杏树根经加工制成的颗粒。银杏又称白果，是我国特有的珍稀树种。近年来，国内外学者对银杏的化学成分、药理作用等做了大量的研究工作。研究发现，其主要成分包括淀粉、蛋白质、酚类、黄酮类、萜类、生物碱、多糖类、氨基酸、微量元素等成分，具有镇咳、平喘、抗菌、抗疲劳、消炎、抗病毒、抗癌等作用［1-2］；其中银杏树根中主要含有黄酮类化合物，不含山奈酚、异鼠李素等物质［3-4］。目前鸭脚通颗粒收录于2007年版《江西省食品药品监督管理局医疗机构制剂标准》，主要质控项目仅为性状、薄层鉴别两个项目，尚未有鸭脚通颗粒的含量测定方法。随着国家对医院制剂标准的提高和规范化管理的加强［5］，为了保证制剂质量，现建立鸭脚通颗粒中总黄酮的含量测定方法，本方法以芦丁为指标性成分采用紫外分光光度法测定鸭脚通颗粒中总黄酮的含量，经方法学验证，该法简便、快捷、准确，可用于鸭脚通颗粒的质量控制。

1　材料

双光束紫外可见分光光度计TU-1901（北京普析通用仪器有限公司）；ME-204（万分之一天平，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司）；CP225D 电子分析天平（十万分之一天平，赛多利斯科学仪器有限公司）。芦丁对照品（92.6%，批号100080-201409，中国食品药品检定研究院）；水为娃哈哈水；鸭脚通颗粒由萍乡市中医院提供；其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1对照品溶液的制备 取芦丁对照品20mg，精密称定，置100mL量瓶中，加70%乙醇70mL，超声处理使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得（每1mL中含芦丁0.2mg）。

2.2供试品溶液的制备 取10袋本品内容物，精密称定，研细，取约2.5g，精密称定，置25mL量瓶中，加70%乙醇20mL，超声处理（功率500W，频率40kHz）20min，放冷，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.3吸收波长的选择 取上述对照品溶液和供试品溶液3.0mL，分别置25mL量瓶中，加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，同法用70%乙醇作空白。采用紫外分光光度计在400～700nm对芦丁对照品溶液、供试品溶液和空白溶剂进行光谱扫描，以确定芦丁对照品溶液和样品溶液的最大吸收波长，最大吸收波长为508nm。

2.4标准曲线的制备 精密量取对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL，分 别 置 25mL量 瓶中，加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液 1mL，混匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min；以相应的溶液为空白。在508nm波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标（Y）、浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。

2.5测定方法 取上述供试品溶液适量，4000r/min离心10min，精密量取上清液3mL，置25mL量瓶中，照“2.4标准曲线的制备”项下的方法，自“加水至6mL”起，依法测定吸光度，通过标准曲线计算供试品溶液中芦丁的量，即得。

2.6方法学考察

2.6.1线性范围考察 按“2.4”项下制备标准曲线供试品，在508nm波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标（Y）、浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程：Y=74.57339X＋0.32877，r=0.9999。结果表明芦丁浓度在7.5300～45.1810μg/mL范围内呈良好线性关系。

2.6.2精密度试验 取同一标准品溶液，按“2.5”项下测定法重复测定6次，测定芦丁吸光度的RSD为0.10%。结果表明该方法具有较好的精密度。

2.6.3重现性试验 取同一批号样品共6份，按“2.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试液，测定芦丁的含量（mg/袋），计算得芦丁含量的RSD为0.58%，表明该方法重现性良好。

2.6.4稳定性试验 取供试品溶液，室温保存，按“2.5”项下测定法测定，分别于0，5，10，15，20，25，30，40，50min测定芦丁的吸光度，测得芦丁吸光度的RSD为2.86%，结果表明供试品溶液在室温下50min内稳定。

2.6.5加样回收率试验 取已知含量（14.38mg/袋）的鸭脚通颗粒样品约1.25g，精密称定，研细，置25mL量瓶中，分别加入适量芦丁标准储备液，按“2.5”项下测定方法测定含量，计算加样回收率（n=6），结果表明芦丁的平均回收率为94.24%（RSD%=2.98），符合方法学要求。见表1。

表1　加样回收率试验结果（n=6）

2.7样品测定 取不同批号鸭脚通颗粒样品，按“2.5”项下测定法测定吸光度，通过标准曲线计算供试品溶液中芦丁的量，结果见表2。

表2　样品含量测定结果（n=3） mg/袋

3　讨论

紫外分光光度法是常见的总黄酮测定方法之一［6］，其中以亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法最常用［7］，以芦丁作为对照，银杏树根中黄酮类化合物与铝盐（NaNO2-Al（NO3）3-NaOH）反应生成红色络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰，故本试验采用比色法测定鸭脚通颗粒中总黄酮的含量。

在提取方法的选择中，比较了以70%乙醇、甲醇、无水乙醇为提取溶剂，结果表明以70%乙醇提取效率最高，分别超声处理10，20，30min，最后确定采用70%乙醇超声（500W，40kHz）处理20min为宜。在做稳定性试验考察时发现样品随着时间的增加，吸光度会逐渐的减少，故制备完对照品、供试品溶液应在50min之内完成测定，严格控制测定的时间。

从对5批鸭脚通颗粒中总黄酮的含量测定结果来看，总黄酮含量相差较大，提示银杏树根原药材的质量存在差别，为避免由原药材引起中成药的疗效差异，因此有必要对其进行质量控制。本文建立了鸭脚通颗粒中总黄酮的含量测定方法，经方法学验证，该方法准确、快速，简便，重现性好，可用于鸭脚通颗粒的质量评价。