三个茯苓品种氨基酸与蛋白质的含量比较

杨　岚，尹火青，唐　娟，袁　涛，杨焕治，陈三春，张　城，彭国平1，，3

(1 湖南农业大学生物科学技术学院，长沙　410128；2 湖南省博世康中医药有限公司，湖南怀化　418000；3 道地药用植物规范化栽培与综合利用湖南省工程实验室，长沙　410128)

茯苓是多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，载于《中国药典》中，作为我国传统的药食两用的中药已有2 000多年的悠久历史，茯苓的主要研究集中在其次生代谢产物上，研究最多的是茯苓多糖，茯苓多糖及其衍生物羧甲基茯苓多糖具有调节免疫力[1]、抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、调节血糖[4]、降血脂[5]和保肝[6]等药理作用。对茯苓中含量少的蛋白质和氨基酸的研究较少，仅有许辅等[7]对茯苓的一种新型免疫调节蛋白的纯化与生理活性在巨噬细胞体外诱导的肿瘤坏死因子有关的基因表达的初步研究。因此，本实验分析了3个茯苓品种蛋白质与氨基酸的含量，为茯苓蛋白质类的药效研究以及茯苓蛋白类保健品产品开发奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材料、仪器与试剂

茯苓材料为“野生型”“湘靖28”“辐射一号”新鲜茯苓菌核，“湘靖28”是在“野生型”中选育出来的，“辐射一号”是辐射育种得到的材料，均同时采自湖南省靖州县茯苓基地同一块地。

R-1001N旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司；722N可见分光光度计，上海精科；KQ-3200E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；全自动凯氏定氮仪，Unit，FOSS TecatorTMDigestor Auto；5417R冷冻高速离心机，德国Eppendorf公司；L-8900日立全自动氨基酸分析仪，KjeltecTM8400 Analyzer；牛血清蛋白，考马斯亮蓝G-250，其余化学试剂均为国产AR级。

1.2　试验材料处理

将3个品种的新鲜茯苓菌核分别切薄片，45℃恒温干燥至恒重并粉碎，100目筛子过筛备用。

1.3　蛋白质标准曲线的制作

精密配置0.5mg/mL的牛血清蛋白标准品溶液，按照稀释倍数原则分别将其稀释，取14支10mL具塞刻度试管编号，分别加入牛血清蛋白标准液，配置标准液浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL，每个试管标号做3个平行组。在每个试管中加入5.0mL现配的考马斯亮蓝G-250，混匀静置 3min，用722N可见分光光度计在595 nm处比色，记录溶液吸光度绘制蛋白质标准曲线，得到回归方程。

1.4　茯苓蛋白质的提取与测定

1.4.1醇溶性蛋白的提取精密称取茯苓干粉末5g于研钵中，加15mL 50%乙醇，研磨成匀浆，转移到50mL离心管中，4℃、12 000r/min常温超声振荡20min，高速冷冻离心20min。取上清液，即为蛋白质粗提液。

1.4.2水溶性蛋白的提取精密称取茯苓干粉末5g于研钵中，加15mL蒸馏水，研磨成匀浆，转移到50mL离心管中，常温超声振荡20min，4℃、12 000r/min高速冷冻智能离心20min后取上清液，为蛋白质粗提液。

1.4.3茯苓总蛋白的测定凯氏定氮法测定：精密称取1g茯苓干粉末于消化管中，按顺序依次加入催化剂CuSO40.5g、K2SO410g和浓H2SO420mL，置于反应器上消化，时间180min，消化温度410℃，打开空气过滤器，计算3个茯苓样品蛋白质的百分含量。

1.4.4茯苓醇溶性蛋白的测定 考马斯亮蓝法测定[8]：取蛋白质粗提液1mL，对照组用1mL超纯水代替蛋白质粗提液并编号，加入5mL考马斯亮蓝G-250后混匀静置3min，用722N可见分光光度计在595 nm处测定吸光度。

1.4.5茯苓水溶性蛋白的测定 考马斯亮蓝法测定：采用真空低温蒸馏法[9]将蛋白质粗提液浓缩5倍，取1mL蛋白质浓缩液于试管中并编号，对照组用1mL超纯水代替蛋白质浓缩液，加入5mL考马斯亮蓝G-250后混匀静置3min，用722N可见分光光度计在595 nm处测定吸光度。

1.5　茯苓样品中氨基酸的检测

1.5.1氨基酸测定茯苓氨基酸按GB/T 5009.124—2003测定，每个样品准备10g。

1.5.2样品预处理精密称取3份等量的茯苓干粉末，置于水解管中冰浴30min，加入2mL预先冷却的过甲酸溶液，0℃静置18 h，加入氢溴酸0.3mL，于0℃摇匀静置30min，通入氮气1min，放入110℃的恒温干燥箱中水解24 h，冷却至室温，加超纯水定容至100mL容量瓶，混合均匀后加入2mL 0.02mol/L的盐酸溶液，用0.2μm的滤膜过滤，滤液上机检测。

1.5.3进样检测设置检测波长为570 nm，其中设置脯氨酸检测波长为440 nm。根据日立公司的使用手册配制标准，泵1(洗脱溶液)，流速0.40mL/min(压力2.0～14.7 MPa)；泵2(茚三酮溶液)，流速0.35mL/min(压力2.0～14.7 MPa)；分析柱温度57℃；反应温度135℃；进样体积20μL。样品测定完后系统自行清洗，最后进行数据处理并打印报告。

2　结果与分析

2.1　茯苓氨基酸测定结果

在本研究中，未检出的酪氨酸(Tyr)和半胱氨酸(Cys)是由于该仪器原因检测的此2种氨基酸含量具有不可靠性，并非是指该测试样品中不含此2种氨基酸，故剔除Tyr和Cys的结果。经氨基酸全自动检测仪检测(表1)，3个茯苓样品中各氨基酸含量除个别氨基酸Ala、Arg、Lys外，含量高低都符合野生型>辐射一号>湘靖28的规律，3个品种的茯苓所含氨基酸种类齐全，辐射一号的8种必需氨基酸含量较丰富，尽管出现了一定差异，但基本在同一个数量级。

表1　3个茯苓品种的氨基酸检测结果单位：g/100g

表2　3个茯苓品种的蛋白含量单位：mg/g

2.2　蛋白质含量测定结果

(1)蛋白质标准曲线[10]：牛血清蛋白标准曲线的方程为Y=0.076X+0.02，R2=0.997 9，R2>0.99 5，其线性相关性好。(2)总蛋白含量测定：用凯氏定氮法分别测得3个茯苓品种的总蛋白含量如表2，总蛋白含量高低为野生型>湘靖28>辐射一号，辐射一号与湘靖28在总蛋白含量上差异不明显。(3)醇溶性蛋白含量测定：用考马斯亮蓝G-250法测得吸光度值，依据蛋白质标准曲线计算得到醇溶性蛋白含量高低为野生型>辐射一号>湘靖28，辐射一号与湘靖28的醇溶性蛋白含量高低与水溶性蛋白含量高低并不成一致的相关性。(4)水溶性蛋白含量测定：用考马斯亮蓝G-250法测得其吸光度，依据蛋白质标准曲线计算得出水蛋白质含量如表2，3个茯苓品种水溶性蛋白含量高低为野生型>湘靖28>辐射一号，与总蛋白含量成一致的规律。(5)在提取茯苓蛋白质时，因为茯苓样品中蛋白质含量很低，需要研磨充分，超声辅助提取，用低浓度乙醇提取所得蛋白质的含量相对较高，这与浓缩过程中蛋白质降解有关。

3　讨论与结论

至今被公认的茯苓的主要功效成分是茯苓多糖和三萜类化合物，对于茯苓中的蛋白质和氨基酸等含量较低的成分研究应用较少，对茯苓的研究不是很完善，不利于阐述茯苓的功效并开展实际应用。本实验比较了3个茯苓品种的氨基酸与蛋白质的含量，结果显示，蛋白质差异不明显，在氨基酸含量方面，传统的野生型最具明显优势，辐射一号优于湘靖28，辐射一号总蛋白和游离氨基酸含量高于湘靖28；从新品种选育来看，辐射一号是营养价值相对高、保健作用最好的材料，是相对较优的品种，可以作为新品种进行推广。蛋白质和游离氨基酸的含量比较可更为全面地评价和控制中药茯苓的质量，而茯苓中蛋白质的研究是一个值得关注的新方向，为茯苓新品种选育和茯苓保健品研究奠定基础。◇