水飞蓟的毒理学安全性评价

韩　超，石丽丽，赵金鹏，李　岩

(中国疾病预防控制中心营养与健康所，北京　100050)

水飞蓟是菊科水飞蓟属的药用植物，具有清热解毒、疏肝利胆的传统功效[1]。水飞蓟的干燥果实经提取、精制而得到的有效成分称为水飞蓟素。在欧美国家，水飞蓟素作为较为经典的保肝药物，被广泛应用于各种肝损伤的治疗。1972年，水飞蓟引入我国作为一种保肝药用植物推广种植[2]。近年来，水飞蓟逐渐应用于保健食品领域，主要用于保护肝功能。目前国内外对于水飞蓟的研究主要集中于其功效方面，关于水飞蓟的食用安全性评价报道较少。本实验通过急性经口毒性实验、三项遗传毒性实验、大鼠30d喂养实验对水飞蓟的毒性做了初步研究，为水飞蓟在保健食品和医药领域的应用提供科学依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

受试物：水飞蓟胶囊的内容物为棕黄色粉末，人体推荐量为972mg/d，即每天16.2mg/kg·BW(成人按60kg体重计)。

1.2实验动物和饲料条件

SD大鼠(SPF级)、昆明种小鼠(SPF级)均由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK(军)2012—0004。动物饲养地点为中国疾病预防控制中心动物房，实验室为屏障环境，温度20～24℃，相对湿度40 %～70%，许可证号为SYXK(京)2014-0043，实验动物实验前在动物房环境中适应3d。

1.3实验菌株

Ames实验选用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌：TA97、TA98、TA100和TA102，菌株均经过生物学鉴定合格后进行实验。

1.4实验方法

1.4.1急性经口毒性实验健康SD大鼠20只，雌雄各半，体重180～220g，采用最大耐受量(MTD)法。受试物给予剂量为18.0g/kg·BW，称取受试物30.0g，加0.5%羧甲基纤维素钠至100mL，终浓度为0.30g/mL。实验前动物隔夜空腹(禁食16h，不限制饮水)，以20.0mL/kg·BW灌胃量进行灌胃，1日3次，每次间隔4h。观察期14d，记录动物中毒症状及死亡情况。

1.4.2Ames实验采用平板掺入法，使用鉴定合格的菌株TA97、TA98、TA100、TA102，用S9混合液作为体外代谢活化系统。实验剂量为5 000、1 000、200、40、8μg/皿。称取受试物1.0g，以0.103 MPa、20min高压灭菌后，加灭菌DMSO定容至20mL，浓度为50 000μg/mL，作为最高剂量浓度。并设立空白对照组、溶剂对照组和阳性对照组，阳性物包括2-氨基芴、甲基磺酸甲酯、1，8-二羟基蒽醌和敌克松，每个组分别设3个平行皿。此实验重复2次，若受试物的回变菌落数是溶剂对照组的2倍以上，且具有剂量反应关系者则为阳性。

1.4.3小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验选用健康昆明小鼠50只，体重25～30g，随机分为5组，每组10只。实验按照一次性最大灌胃剂量方法进行剂量设计，3个剂量组分别为1.50、3.00、6.00g/kg·BW，另设溶剂对照组和环磷酰胺阳性对照组(40mg/kg·BW)。采用间隔24 h两次经口灌胃法进行实验，按20mL/kg·BW灌胃，第2次给予受试物6 h后颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓制片。每只动物计数200个嗜多染红细胞(PCE)，计算嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值(PCE/NCE)；并观察1 000个PCE中含微核的细胞数，统计微核发生率。

1.4.4小鼠精子畸形实验实验选用健康性成熟雄性昆明小鼠30只，体重25～35g。按照一次性最大灌胃剂量方法进行剂量设计，3个受试物剂量组分别为1.50、3.00、6.00g/kg·BW，另设溶剂对照组和环磷酰胺阳性对照组(40mg/kg·BW)。灌胃量为20mL/kg·BW，连续5d灌胃给予受试物。实验第35d，颈椎脱臼处死小鼠，取两侧附睾精子滤液制片、镜检。每只小鼠计数1 000个精子，并计算精子畸形率。

1.4.5大鼠30d喂养实验选用健康断乳SD大鼠80只，设对照组和3个剂量组，每组20只，雌雄各半。根据样品的人体推荐量设立3个剂量组，分别为0.41、0.81、1.62g/kg·BW。按大鼠每日100g体重进食10g饲料计算，低、中、高剂量组分别取81、162、324g的受试物添加饲料至20kg。对照组给予基础饲料。实验期间，每天观察并记录动物的生长状况，每周称1次体重，记录每周进食量并计算食物利用率。30d 后麻醉腹主动脉取血检测血液学和血液生化学检查。对每只大鼠进行大体解剖，对肝、肾、脾和睾丸(卵巢)进行称重，计算脏体比。对照组和高剂量组的肝、肾、脾、胃、十二指肠和睾丸(卵巢)进行病理组织学检查。

1.4.6数据统计分析采用 SPSS软件进行数据统计，微核实验采用泊松分布检验统计，精子畸形实验采用卡方检验进行统计，大鼠30d喂养实验采用方差分析，以α=0.05作为显著性水平。

2　结果与分析

2.1急性毒性实验水飞蓟以18.0g/kg·BW剂量灌胃给予大鼠，14d内未见实验动物出现中毒症状和死亡情况，表明水飞蓟对雌、雄两种性别的大鼠的急性毒性最大耐受剂量均大于18.0g/kg·BW。

2.2遗传毒性实验

2.2.1Ames实验在加S9与不加S9的情况下，各实验组在相同实验条件下重复2次实验，结果表明，水飞蓟各剂量组的回变菌落数都没有超过自发回变菌落数的2倍，并且各剂量组间未出现明显的剂量反应关系。因此，水飞蓟对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102不具有致突变作用。

2.2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验与阴性对照组相比，水飞蓟各剂量组嗜多染红细胞(PCE)与成熟红细胞(NCE)的百分比并未低于20%，说明在此实验剂量下水飞蓟未表现出细胞毒性；环磷酰胺阳性组的微核率显著升高(P<0.01)，而各剂量组的微核率并未出现显著性差异(P>0.05)，表明水飞蓟对小鼠骨髓嗜多染红细胞未产生致突变作用(表1)。

2.2.3小鼠精子畸形实验与阴性对照组相比，水飞蓟各剂量组的精子畸形率未出现显著性差异(P>0.05)，而环磷酰胺阳性组与阴性对照组相比，具有显著性差异(P<0.01)，表明水飞蓟对小鼠精子无致畸作用(表2)。

2.3大鼠30d喂养实验

2.3.1生长状况及食物利用率实验期间，所有动物活动正常，无明显中毒症状，生长发育良好。与对照组相比，各剂量组动物体重、增重、进食量和食物利用率均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表1　小鼠骨髓细胞微核实验结果

表2　精子畸形实验结果

表3　水飞蓟胶囊对大鼠体重、食物总摄入量和食物利用率的影响

表4　水飞蓟胶囊对大鼠血液学的影响

2.3.2血液学指标各剂量组大鼠实验末期血液学指标与对照组比较，0.41、0.81g/kg·BW剂量组雌性大鼠嗜酸细胞百分比与对照组比较显著升高(P<0.01)，0.81g/kg·BW剂量组雄性大鼠中性细胞百分比与对照组比较显著降低(P<0.01)，但以上各指标的差异均在本实验室对照组历史正常检测范围内，且剂量组之间并无剂量反应关系，因此上述差异无生物学意义，其余各剂量组血液学检测结果与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)(表4、表5)。

2.3.3血液生化指标各剂量组大鼠实验末期血液生化指标与对照组比较，0.41g/kg·BW剂量组雌性大鼠的谷丙转氨酶显著升高(P<0.05)，但此指标的变化在实验室对照组历史正常检测范围内，该指标的升高无生物学意义。1.62g/kg·BW剂量组雌性大鼠谷草转氨酶明显低于对照组(P<0.05)，该指标的降低无生物学意义。其余各剂量组血生化检测结果与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)(表6、表7)。

2.3.4对大鼠脏器重和脏体比的影响各剂量组大鼠脏器重肝、脾、肾、睾丸(卵巢)及实验末空腹体重、脏体比肝/体、脾/体、肾/体、睾丸(卵巢)/体和阴性对照组比较均无显著性差异。

2.3.5组织病理学检查对照组、高剂量组各有1只动物出现肝细胞点状坏死，此肝脏病理学改变是动物常见自发病变，并且高剂量组的病变发生率与对照组无显著性差异，因此该病变和受试物无关。肾、脾、胃及十二指肠、睾丸和卵巢未发现明显异常。因此，与对照组比较，水飞蓟并未引起动物肝、肾、脾、胃及十二指肠、睾丸(卵巢)的病理学改变。

表5　水飞蓟胶囊对大鼠白细胞分类的影响

表6　水飞蓟胶囊对大鼠血液生化指标的影响

表7　水飞蓟胶囊对大鼠血液生化指标的影响

3　讨论

近年来，已有多项研究证实，水飞蓟素不仅在保护肝功能方面具有良好的疗效，还可以保护心肌细胞、防治糖尿病，具有降血脂、抗肿瘤等作用[3-5]。朱淑云等[6]研究发现，水飞蓟粕对小鼠无急性毒性作用，小鼠的经口LD50>15g/kg·BW；杨鸿武等[7]研究水飞蓟胶囊的亚慢性毒性，未发现水飞蓟胶囊具有明显亚慢性毒性，最大未观察到有害作用剂量为8g/kg·BW。本次实验结果与黄凰等[8]的研究结果一致，水飞蓟在急性毒性、三项遗传毒性和亚慢性毒性等实验中无明显毒副作用。

本实验条件下，水飞蓟对雌、雄大鼠的急性经口最大耐受量(MTD)均大于18.0g/kg·BW。Ames实验、小鼠骨髓微核实验和精子畸形实验结果均未见该样品有致突变作用。大鼠30d喂养实验结果显示，实验动物活动正常，无明显中毒症状，生长发育良好，各剂量组动物体重、进食量、食物利用、血液学、血液生化学、组织病理学指标等均未见异常。因此，在本实验条件下水飞蓟未见明显毒副作用，为水飞蓟作为保健食品的研究开发提供了重要的毒理学科学依据。◇