中西药联用对水貂源铜绿假单胞菌体外抑菌作用

朱利霞，王洪彬，杨　楠，周　平，张　婷，史秋梅*，高光平*

(1.河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛 066604；2.乐亭县畜牧兽医局， 河北唐山 063600)

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)旧称绿脓杆菌，为假单胞菌属成员，是临床上比较常见的致病菌之一，可以引起多种继发和混合感染，也可以作为一种原发性病原菌引起狐狸、水貂、貉、禽等感染发病[1]。目前，养殖业发展迅速，临床上由铜绿假单胞菌引起的毛皮动物出血性肺炎日益增多，且呈逐年增长的态势。铜绿假单胞菌本身具有多重耐药性，加之临床上抗生素和化学药物的不合理使用，铜绿假单胞菌的耐药问题日渐严重，引起了广泛关注[2]。对铜绿假单胞菌感染的治疗目前仍然以抗生素和化学药物治疗为主[3]，在这些药物大量使用的同时，也出现了细菌耐药性增加、药物残留量高等一系列问题；然而中草药具有价格低廉、来源广泛、长期使用不产生耐药性等独特的优势[4]，因此中西药联用逐渐成为防治水貂铜绿假单胞菌病的重要途径之一。基于此，本研究以水貂源铜绿假单胞菌临床分离株为试验菌株，并选用氟苯尼考、环丙沙星和阿米卡星3种西药以及黄芩、连翘和诃子3种中草药组成9个中西药物组合测定抑菌活性，以期为进一步筛选有效药物组合，防治秦皇岛地区毛皮动物铜绿假单胞菌病提供参考。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1药物黄芩、诃子、连翘，购自秦皇岛民乐医药；阿米卡星、环丙沙星、氟苯尼考，由河北科技师范学院动物科技学院河北省预防兽医学重点实验室购买后提供。

1.1.2试验菌株铜绿假单胞菌，由河北科技师范学院动物科技学院河北省预防兽医学重点实验室工作人员从临床发病水貂分离、鉴定，最终确定为致病性铜绿假单胞菌，并保存于本实验室-80℃冰箱。

1.1.3培养基营养肉汤(Nutrient Broth，简称NB)、营养琼脂培养基(Nutrient Agar，简称NA)、96孔细菌培养板，青岛高科园海博生物技术有限公司产品。

1.2　方法

1.2.1中草药药液的制备参照文献[5]的方法，在此基础上略加改动，制备中草药药液。用天平准确称取黄芩、诃子和连翘各50 g，分别加入10倍体积的水浸泡40 min，先用武火煮沸后，改用文火煎煮。3种药物首煎均为30 min，二煎和三煎均为20 min。煎煮过程中注意边煮边搅拌，每次所得药液均用4层纱布过滤，收集滤液；另外分别在药渣中添加100 mL水混匀后，文火煎煮10 min，过滤，收集滤液；最后将得到的滤液合并之后用文火浓缩至50 mL，即中草药药液终浓度为1 g/mL。药液经121℃、15 min高压蒸汽灭菌后，分装，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.2西药药液的制备用电子天平准确称取西药阿米卡星、环丙沙星以及氟苯尼考固体粉末，置于容量瓶中，加入灭菌的pH7.8的PBS溶解药物，制成终浓度为2 560 μg/mL的药液，用直径为0.22 μm的微孔过滤器过滤除菌后，分装于EP管中，置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.3试验菌液的制备取出于-80℃冰箱保存的水貂源铜绿假单胞菌甘油冻存菌株，划线接种于营养琼脂平板上，并将平板置于37℃隔水式恒温培养箱中，培养12 h～16 h；于营养琼脂平板上挑取单个菌落，接种于6 mL营养肉汤培养基(NB)中，于37℃隔水式恒温培养箱培养12 h；将菌液倍比稀释，采用琼脂平板法计数，并稀释至终浓度为1×107CFU/mL，备用。

1.2.4中、西药单药最小抑菌浓度的测定采用试管二倍稀释法[6]测定各药液对水貂源铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)。取无菌带有棉塞的试管11支，标号1～11；每管加入3 mL营养肉汤培养基，然后在第1个试管里加入无菌药液3 mL，混合均匀后，吸取3 mL至第2管中，重复以上操作直至第9管，吸取3 mL到第11管，混匀后弃去3 mL；第10管不加药液作为阳性对照；吸取已经稀释好的菌液(浓度为1×107CFU/mL)100 μL分别加入1～10号管中，第11号管不接菌，加入等量的生理盐水，作为阴性对照，然后置于37℃隔水式恒温培养箱中培养12 h～16 h。观察试验结果，以肉眼观察各个试管液体澄清时的最低药液浓度即为最小抑菌浓度(MIC)。

1.2.5最小杀菌浓度(MBC)的测定在1.2.4的基础上将所有无菌生长的各个试管中样品吸取100 μL涂布于营养琼脂平板上，于37℃培养12 h～16 h，观察结果。平板上无菌生长的最低药物浓度为最小杀菌浓度(MBC)[7]。

1.2.6中西药联用指数测定采用微量肉汤棋盘稀释法[8]，在此基础上略加改动测定中西药联用指数(FIC)。测定3种中药和3种西药联用时的FIC。取96孔细菌培养板，以水貂源铜绿假单胞菌为试验菌株，每孔加入200 μL菌液，根据单药MIC值的检测结果，以2MIC甲为最高稀释浓度，吸取100 μL沿着96孔板的横轴依次倍比稀释至1/16MIC甲，以2MIC乙为最高稀释浓度，沿着96孔板的纵轴依次稀释至1/16 MIC乙，在微量震荡器震荡3 min，37℃恒温培养箱中培养12 h～16 h，测定中西药联用时的MIC值。由公式FIC值=甲药联用时MIC值/甲药单用时的MIC值+乙药联用时MIC值/乙药单用时的MIC值。

参照文献[9]对试验结果进行判定：FIC≤0.5时，为显著协同作用；0.5

2　结果

2.1　药物对水貂源铜绿假单胞菌MIC和MBC测定

结果见表1。表1结果表明，试验所选择的6种药物对水貂源铜绿假单胞菌均有一定的抑菌作用。3种中草药对水貂源铜绿假单胞菌的抑菌效果以诃子(MIC值为31.25 mg/mL、MBC值为62.5 mg/mL)抑菌、杀菌效果最优，其次为连翘(MIC值为62.50 mg/mL、MBC值为125 mg/mL)，黄芩(MIC值125 mg/mL、MBC值为250 mg/mL)抑菌、杀菌效果稍差；3种西药对水貂源铜绿假单胞菌的抑菌、杀菌效果以环丙沙星(MIC值和MBC值均为3.125×10-4mg/mL)最优，氟苯尼考和阿米卡星两者MIC值和MBC值均相等，抑菌、杀菌效果相当。因此一旦暴发细菌病，可以选择抑菌、杀菌性较强的药物如环丙沙星去防控，此外合理安排用药的使用量。

表1　药物对水貂源铜绿假单胞菌MIC和MBC

2.2　中西药联用指数(FIC)

结果见表2。表2结果表明，试验选用3种西药和3种中草药共组成9个药物组合。抑菌作用为显著协同作用的药物组合为氟苯尼考和黄芩、连翘、诃子组合，阿米卡星和连翘组合以及环丙沙星和连翘组合，说明这些药物联用时可以使抑菌作用显著增强；环丙沙星和诃子组合效果上则表现为协同作用，使抑菌作用增强；阿米卡星和黄芩联用时抑菌效果是两者单用时效果之和；环丙沙星和黄芩组合在抑菌方面表现为无关作用，联用时不能提高抑菌效果；阿米卡星和诃子组合联用时，抑菌效果比单独使用时抑菌效果都弱，因此生产实践中为提高抑菌效果可以选用具有显著协同作用的中西药物组合，如氟苯尼考和黄芩组合、氟苯尼考和连翘组合、氟苯尼考和诃子组合、环丙沙星和连翘组合以及环丙沙星和诃子组合。

表2　中西药联用指数(FIC)结果

3　讨论

近年来，对毛皮动物需求量增加，毛皮动物市场逐步扩大，中国毛皮动物养殖业迅猛发展，尤其是在山东、河北、黑龙江等地区。从1950年，各国均有铜绿假单胞菌感染引起的毛皮动物如水貂、狐狸等出血性肺炎的报道[10]。1982年，Gersard第一次从伤口感染的脓汁中分离到该菌。2011年，有文献报道了河北省某县养殖场饲养的水貂引发了出血性肺炎，3 d内死亡水貂153只，最终证实了是铜绿假单胞菌感染引起的[11]。2013年10月，山东省文登市某毛皮动物养殖场水貂患铜绿假单胞菌病，临床表现为精神沉郁、呼吸困难、食欲减退，口鼻流红色泡沫状液体，剖检肺脏、脾脏、肝脏严重出血[12]。李蕴玉等[13]报道了铜绿假单胞菌感染毛皮动物如狐狸、貂等，能够引起多种动物的出血性肺炎，给养殖户带来巨大经济损失。铜绿假单胞菌是引起毛皮动物出血性肺炎的重要细菌性疾病的病原之一，常表现为出血性肺炎和败血症，且发病急、病死率高[14]。同时该菌还能感染人，是一种人兽共患病原菌，因此具有重要的公共卫生学意义。昌莉丽等[8]报道了氟苯尼考和黄芩联用可使药物对禽源大肠埃希菌的抑菌活性增强。黄伟[15]报道氟苯尼考和黄芩联用喂鸡，证实了黄芩会加速氟苯尼考的吸收速度，加速该药在体内的消除速度，说明两者联用后不仅可以增加疗效，且起效快、减少药物残留。罗智勇等[16]报道了双黄连与氟苯尼考联用时，对猪支原体、鸡流感病毒、支原体均具有较好疗效。此外，中西药联用在鸭疫里默氏杆菌以及鹅巴氏杆菌上均取得了较为理想的体外抑菌效果[17-18]。相关研究表明，麻杏石甘汤与青霉素联用可以产生协同作用，提高药物对铜绿假单胞菌的治疗效果，并能够减少抗生素的使用剂量[19]。因此，中西药联用对细菌病的防控具有良好的前景。

本研究结果表明，氟苯尼考分别与黄芩、诃子、连翘联用，以及连翘分别与阿米卡星和环丙沙星联用，对铜绿假单胞菌在抑菌效果上均表现显著协同作用；此外，阿米卡星和黄芩联用，以及环丙沙星和诃子联用，均能使药物对铜绿假单胞菌的体外抑菌效果增强，足以说明中西药联用对铜绿假单胞菌具有一定程度的抑菌作用。尽管有关中西药联用对铜绿假单胞菌抑菌作用的研究较少，但是大量的研究证实了中西药联用在多种细菌上均有较好的抑菌效果，因此有理由相信中西药联用在今后铜绿假单胞菌病的防控中具有良好的发展前景。

中西药联用是中西医结合治疗细菌性疾病的重要形式和有效途径，中、西药物各有所长，相互配伍使用常能发挥协同作用，提高治疗效果，降低毒副作用[20]，但是中药成分复杂，药理作用机制复杂，在与西药联用的过程中一定要合理配伍，否则不但会降低疗效，甚至药效丧失，还可能造成更大的毒副作用，影响动物机体的健康。中西药能否联用，原因复杂，既有化学、物理反应，又有毒理、药理作用，因此一定要以现代药物与疾病的理论知识为基础，合理使用药物，这样才能真正达到中西药联用的目的。