乌龙茶多糖和多酚对肝癌细胞HepG2的协同抑制作用

姚　莉，蒋爱民，杨承鸿，李淑红

(1.华南农业大学食品学院，广东广州 510400；2.广东科贸职业学院生物技术系，广东广州 510430)

原发性肝癌是指发生于肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤，是临床上最常见的恶性肿瘤之一[1]。据2015年中国癌症统计数据显示，肝癌发病率居恶性肿瘤第4位，死亡率居第3位[2]。目前在肿瘤化疗过程中，抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞的增殖也有杀伤作用，因而化疗疗效受到限制。目前，国内外许多研究表明，乌龙茶具有调节机体免疫、抗病毒、保肝、抗氧化等药理作用，尤其是其抗肿瘤活性日益受到关注[3]。高分子量乌龙茶多糖、多酚是乌龙茶提取物中的主要活性成分，对动物移植性肿瘤具有抑制作用，可使肿瘤质量减轻、体积减小，生存时间得以延长[4]。倪德江等[5]研究发现，茶多糖具有清除·OH和O2-·自由基能力，且多糖的结构对其生物活性产生很大的影响，Chen H等[6]研究发现，多糖组成及其分子质量分布与其抗氧化活性有很大关系；Lu Y R等[7]研究发现，茶多酚的抗癌作用主要是通过清除自由基、抑制促癌酶的代谢过程、改变线粒体通透性等多种途径发挥抗癌作用；王振云等[8]发现，茶多酚还可以通过激活内部线粒体途径促进肿瘤细胞的凋亡，裂解相应的胞浆胞核底物，导致细胞凋亡，从而起到抗癌作用。因此本研究主要是以人肝癌细胞HepG2为试验对象，应用四氮甲唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)试验和流式细胞仪等技术，研究高分子量乌龙茶多糖、多酚对肿瘤细胞的生长、增殖的抑制作用，以及两者协同作用对肿瘤细胞的杀伤作用，为肿瘤临床治疗提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1试剂高分子量乌龙茶多糖(相对分子量8.877×104，纯度≥93%)、多酚(纯度≥95%)，吉林农业科技学院研制；四氮甲唑蓝(MTT )，Sigma公司产品；RPM 1-1640培养基，Nissui日本日水公司产品；其余试剂均为国产分析纯试剂。人肝癌 BEL-7404细胞株，由中国科学院细胞研究所引入；肝癌HepG2细胞，购自上海汉博生物科技有限公司。

1.1.2主要仪器流式细胞仪(BD Biosciences FACSAria III ，USA)、全自动酶标仪(WD-2102A 3350 630 nm)。

1.2　方法

1.2.1细胞培养肝癌HepG2细胞，用50 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃体积分数为5%的CO2培养箱传代培养。每24 h～48 h传代1次。控制细胞密度为2×105个/mL，加药时稀释培养液，加入无血清BRMI 1640配制成的各组含药培养液200 μL，于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱共孵育48 h，监测各项指标。

1.2.2分组方法将2×105个/mL细胞接种于96孔培养板内，分为3个组：(1)对照组；(2)乌龙茶多糖单独用药组：每孔加入不同浓度的乌龙茶多糖(50、100、200、400、800 μg/mL)；(3)多酚单独用药组：每孔加入不同浓度的多酚(50、100、150、200、250 μg/mL)；(4)乌龙茶多糖与多酚联合用药组：每孔加入经(2)和(3)筛选出的乌龙茶多糖与多酚的最佳浓度。其中每组做6个重复孔，常规培养48 h。

1.2.3MTT法检测细胞抑制率将1.2.2中每组加入MTT 20 μL/孔(5 mg/mL)3 h，测定前弃去上清液后加入溶解液100 μL/孔。置漩涡振荡器5 min，待紫色颗粒溶解之后,用全自动酶标仪测定每孔光密度，计算细胞生长抑制率，试验重复6次。细胞抑制率计算公式为：

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡率参照文献[9-10]，样品处理同上，在药物作用不同时间收集细胞。用PBS液洗2次，加入700 mL/L(V/V)冷乙醇，4℃固定24 h以上，随后清洗细胞加入PI染液，孵育30 min，进行DNA染色，采用流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率。

1.2.5统计学处理通过Microsoft Excel进行数据处理，采用Origin8.0软件作图，采用SPSS 17.0统计软件对测定指标进行单因素方差分析，显著性水平为P<0.05。

2　结果

2.1　单独用乌龙茶多糖对肝癌细胞的抑制作用

乌龙茶多糖对肝癌HepG2细胞增殖的影响见表1。由表1可见，随着乌龙茶多糖浓度的提高，细胞培养液的光密度OD值逐渐降低，对肝癌细胞HepG2增殖的抑制率也逐步的提高。当乌龙茶多糖浓度达到800 μg/mL时，其对肝癌细胞HepG2增殖的抑制率为38.31%，约为浓度为50 μg/mL时抑制作用(7.94%)的5倍，抑制作用显著提高(P<0.05)。这可能是由于乌龙茶多糖具有具有清除·OH和O2-·自由基的能力，可明显降低肝脏肿瘤发生前的谷胱甘肽S-转移酶胎盘类型阳性病灶的数量和体积，且乌龙茶多糖还具有抗氧化作用以及改变代谢酶类的作用，因而随着乌龙茶多糖浓度的提高，抗氧化以及自由基清除分子增加，产生抑制肝癌细胞HepG2增殖作用。

2.2　单独用多酚对肝癌细胞的抑制作用

多酚对肝癌HepG2细胞增殖的影响见表2。由表2中可见，随着多酚浓度的提高，细胞培养液的光密度OD值逐渐降低，说明随着多酚浓度的提高，肝癌细胞HepG2增殖所受到的抑制作用也越强。多酚浓度在0～150 μg/mL范围内，多酚浓度的增加可显著(P<0.05)提高对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用，而当多酚浓度超过150 μg/mL后，肝癌细胞HepG2增殖所受到的抑制作用增加不显著(P>0.05)。这可能是由于茶多酚为非细胞毒类药物，其主要成分是复合儿茶素，具有很强的抗氧化作用，能够有效防止自由基对DNA大分子的损伤和脂质过氧化作用，也可能是由于茶多酚通过调控基因，抑制与癌发生相关基因的表达，诱导癌症细胞凋亡等作用，达到防癌和抗癌的作用[11]。多酚浓度在0～150 μg/mL范围内，随着多酚浓度的不断提高，细胞培养液中所接触的多酚有效抗癌成分增加，因而使得肝癌细胞HepG2增殖受到的抑制作用增强。而当多酚浓度超过150 μg/mL后，继续增加浓度，肝癌细胞HepG2与多酚分子抗癌之间的接触达到饱和状态，因而不能显著增加抑制作用(P>0.05)。

表1　乌龙茶多糖对肝癌HepG2细胞增殖的影响

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

表2　多酚对肝癌HepG2细胞增殖的影响

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

2.3　乌龙茶多糖与多酚对肝癌细胞的协同抑制作用

由上述试验结果，选取空白对照组、乌龙茶多糖组(乌龙茶多糖浓度为400 μg/mL)、乌龙茶多糖+多酚组(乌龙茶多糖浓度为400 μg/mL+多酚浓度为150 μg/mL)以及多酚组(多酚浓度为150 μg/mL)，观察4组对肝癌细胞HepG2增殖的影响(图1)。

由图1中可以看出，乌龙茶多糖与多酚联合应用，其对肝癌细胞HepG2增殖有明显抑制作用，且联合用药组的抑制作用要显著优于2种药物单独使用(P<0.05)。乌龙茶多糖(400 μg/mL)经与多酚(150 μg/mL)联合应用后，细胞抑制率为52.71%，乌龙茶多糖(400 μg/mL)及多酚(150 μg/mL)单独应用,细胞抑制率分别为为34.71%和35.03%。联合应用使得细胞抑制率提高了约1.5倍。结果表明，乌龙茶多糖与多酚联合应用，可以增强其单独对肝癌细胞HepG2的抑制作用，二者起到了协同抑制作用。这可能是由于单独应用使得药物作用靶向部位比较单一，联合应用扩大了药物的抑制范围，增强药物的作用。

2.4　乌龙茶多糖与多酚协同对细胞凋亡的影响

流式细胞仪(Annexin V/PI)法检测肝癌细胞HepG2在药物作用48 h后的凋亡百分率，结果见图2。试验结果显示，单独应用高分子质量乌龙茶多糖组及多酚组肝癌细胞HepG2的凋亡率分别为11.10%±0.30%和25.87%±0.65%，明显低于联合应用的细胞凋亡率47.23%±0.25%，差异极显著 (P<0.01)，说明高分子质量乌龙茶多糖和多酚的联合使用对于肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用更加明显，此结果与上述结果一致。

A.空白对照组；B.400 μg/mL乌龙茶多糖；C.400 μg/mL乌龙茶多糖+150 μg/mL多酚；D.150 μg/mL多酚

A.Blank control group;B.400 μg / mL oolong polysaccharide;C.400 μg/mL oolong polysaccharide+150 μg/mL polyphenol;D.150 μg/mL polyphenol

图1乌龙茶多糖与多酚协同对肝癌HepG2细胞增殖的影响

Fig.1Synergistic effect of oolong polysaccharide and polyphenol on HepG2 cell proliferation

A.400 μg/mL乌龙茶多糖；B.150 μg/mL多酚；C.400 μg/mL乌龙茶多糖+150 μg/mL多酚

A.400 μg/mL oolong polysaccharide;B.150 μg/mL polyphenol;C.400 μg/mL oolong polysaccharide+150 μg/mL polyphenol;

图2乌龙茶多糖与多酚协同对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

Fig.2Synergistic effects of oolong polysaccharide and polyphenol on apoptosis of HepG2 cells

3　讨论

本试验所用乌龙茶多糖、多酚是从福建乌龙茶中经化学新工艺和高科技手段提取而来，有研究证实，乌龙茶多糖与多酚具有抗氧化以及广泛的抗癌活性[12-15]。本试验采用不同浓度的乌龙茶多糖、多酚作用肝癌细胞HepG2后，细胞的生长、增殖受到明显的抑制。流式细胞仪检测发现，单独应用乌龙茶多糖组及多酚组肝癌细胞HepG2的凋亡率显著低于联合应用的细胞凋亡率(P<0.05)，改变细胞周期，抑制癌症的发生。目前在临床应用中的抗癌药物在杀死癌细胞的同时，对机体正常组织也会有一定的损害，有一定的副作用，使化学治疗药物剂量受到了极大地限制。本试验结果显示，乌龙茶多糖、多酚的联合用药，肝癌细胞HepG2生长抑制率高达52.71%，起到了明显的杀伤肿瘤细胞的作用，在临床中可以减少化学药物的使用剂量，其作用机制尚有待于进一步研究。