炙甘草汤对慢性疲劳综合征大鼠行为和4种白介素水平的影响

刘伟成，黎杰轩，郭永宁，胡　兰，刘鸿杰，蔡海荣

(1.广州中医药大学，广东广州510006；2.佛山市中医院，广东佛山 528000)

慢性疲劳综合征(Chronic fatigue syndrome，CFS)是一种包括慢性反复发作的体力疲劳和脑力疲劳等为主要表现的临床症候群[1-2]。慢性疲劳综合征是一种介于疾病和健康之间的一种亚健康状态，其发病机制尚不明确[3]。有研究表明，免疫系统中的白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素12(interleukin-12，IL-12)等炎症因子参与了慢性疲劳综合征的发生和发展[4]。现代医学对慢性疲劳综合征缺乏有效的治疗手段，中医药治疗本病具有一定特色和优势[5]，可以明显改善症状，提高生活质量，但是关于其作用机制尚不明确。因此，本试验建立了慢性疲劳综合征大鼠模型，运用炙甘草汤进行干预，观察其对体质量、旷场试验、力竭游泳试验和血清IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12水平的影响，以探讨其防治慢性疲劳综合征的可能机制。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1动物和饲料SD健康雄性大鼠45只，SPF级，10周龄，体重量200 g±10 g,基础饲料,均由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK(粤)2013—0002。

1.1.2药品炙甘草汤(炙甘草15 g，生姜10 g，桂枝10 g，人参6 g，生地黄15 g，阿胶6 g，麦冬10 g，麻仁10 g，大枣15 g)，由广东康美药业股份有限公司提供，经营许可证号为粤AA2001217；将上述中药饮片加8倍量的水浸泡30 min后，煎煮40 min取药液过滤另存，再加6倍量的水煎煮40 min后取液过滤，将2次药液混合，置于100℃环境浓缩至1 mL，相当于原药6 g，置于冰箱保存；生理盐水，上海百特医疗用品有限公司产品，规格：10 mL/支，批号2017010。

1.1.3试剂和仪器大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12 ELLISA试剂盒，Intivrogen公司产品；上海恒平AE523C电子分析天平，购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；TGL16D冷冻离心机，购自湖南迈达仪器有限公司；日立荧光分光光度计F-2700，购自广州市仪德科学仪器有限公司；水合氯醛，扬州市奥鑫助剂厂产品；902-ULTS超低温冰箱，美国Thermo公司产品。

1.2　方法

1.2.1造模方法和分组所有大鼠在造模前置于室温24℃±2℃和湿度50%±5%条件下给予基础饲料适应性喂养1周，待其代谢状态稳定后随机分为空白对照组(15只)、模型组(15只)和炙甘草汤组(15只)，每5只分笼喂养。模型组和炙甘草汤组采取慢性束缚法加冷水游泳法，隔天交替进行建立慢性疲劳综合征模型。单日进行慢性束缚法：自制束缚筒，大小以装进大鼠但是其头部不能自由转动为宜，将大鼠头向通风口钻进束缚筒，调节其不强烈反抗，后架于木板上，每次束缚30 min，隔天进行。双日进行冷水游泳法：制备大小190 cm×80 cm×80 cm的游泳池，设置水深50 cm，水温10℃±1℃，每次将大鼠放入游泳8 min，隔天进行。共造模4周。造模期间所有大鼠均自由进食基础饲料和蒸馏水。

1.2.2给药方法参照人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表，炙甘草汤组给予12 g/kg炙甘草汤灌胃，日灌胃1次。空白对照组和模型对照组给予等体积的生理盐水灌胃，给药周期为2周。

1.2.3试验指标检测采血前禁食不禁饮12 h， 100 g/L水合氯醛溶液(3 mL/kg)经腹腔注射麻醉，经颈总动脉取血10 mL，3 000 r/min离心20 min后取血清，置-70℃保存。ELISA法测定血清IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12的水平。

1.2.4旷场试验将大鼠置于地面为25个等面积的方格和内壁涂黑的箱子(80 cm×80 cm×80 cm)内，测定6 min内大鼠穿越方格的格数(以四爪均进入同一方格为准)为水平运动次数，以后肢垂直(前爪腾空或攀附箱壁)为直立次数。

1.2.5力竭游泳时间将大鼠置于水深50 cm，温度25℃±1℃的泳池中进行游泳，以大鼠入水至头部10 s不能浮出水面为力竭游泳时间。

2　结果

2.1　各组大鼠体重检测结果

造模4周后，模型组和炙甘草汤组大鼠的体重显著低于对照组(P<0.05)。药物干预2周后，模型组体重显著低于对照组，炙甘草汤组体重较模型组显著升高(P<0.05)(表1)。

2.2　各组大鼠力竭游泳时间、穿格次数及直立次数的检测结果

造模4周后，模型组和炙甘草汤组大鼠的力竭游泳时间、穿格次数、直立次数显著低于对照组(P<0.05)。药物干预2周后，模型组力竭游泳时间、穿格次数、直立次数显著低于对照组，炙甘草汤组力竭游泳时间、穿格次数、直立次数较模型组显著升高(P<0.05)(表2)。

表1　各组大鼠体重检测结果

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，ΔP<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

2.3　各组大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-6及IL-12的检测结果

药物干预2周后，模型组血清IL-1β、IL-6显著高于对照组，而血清IL-2、IL-12水平显著降低，差异显著(P<0.05)；与模型组比较，炙甘草汤组血清IL-1β、IL-6显著降低，而血清IL-2、IL-12水平显著升高(P<0.05)(表3)。

表2　各组大鼠力竭游泳时间、穿格次数及直立次数的检测结果

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，ΔP<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

表3　各组大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-6及IL-12的检测结果

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，ΔP<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

3　讨论

慢性疲劳综合征主要为极度的体力疲劳和脑力疲劳，其特征为低热、肌肉酸痛、疲倦乏力、免疫学异常等，是机体的一种亚健康状态。目前，现代医学治疗慢性疲劳综合征主要以补充维生素和营养为主，效果不佳，其发病机制尚不完全明确[6]。有研究显示，免疫系统功能紊乱在慢性疲劳综合征的发生发展过程中起到非常重要的作用，其中细胞因子与慢性疲劳综合征息息相关，慢性免疫激活状态导致细胞因子释放增多或减少，从而扰乱神经递质的功能，导致CFS症状出现[7]。IL-1β是急性期免疫调节因子，其可以直接作用于垂体-肾上腺素轴，促进促肾上腺皮质激素释放增加，介导机体的应激反应。有研究指出，大鼠运动应激后血清IL-1β水平持续升高，提示免疫功能低下[8]。IL-6是疲劳诱导因子，有研究指出，疲劳患者其血清IL-6分泌增加，给予IL-6激活剂后可增加疲劳感，反之给予IL-6抑制剂可减轻疲劳感[9]。IL-6同样可以促进促肾上腺皮质激素的释放而介导应激反应。IL-1β和IL-6不仅影响摄食、睡眠，还可以诱导疲劳、抑郁等不良精神症状，出现疲倦乏力、肌肉酸痛等疲劳综合征[10-11]。IL-2是一种重要的细胞调节因子，由T细胞分泌产生，通过细胞介导细胞内的信号转导而促进免疫应答，其水平越高，提示免疫功能越好。IL-12是一种多功能免疫调节因子，不仅可以介导T辅助细胞的增殖，诱导NK细胞产生干扰素，而且在免疫过程具有重要的作用，其水平越高，提示免疫功能越正常。

关于慢性疲劳综合征大鼠模型建立的方法主要有慢性束缚法、冷水游泳法、电刺激法、跑台法、夹尾应激法、免疫诱导法等。慢性疲劳综合征是一个多因素长期作用的结果，一般有负面情绪、生活刺激、精神紧张、劳累等多因素的长期影响，因此决定了CFS大鼠的造模方法是一个复合应激法。冷水游泳法不仅可以诱导大鼠疲劳，而且可以诱导绝望情绪的产生。慢性束缚法可以诱导大鼠出现抑郁、焦虑、愤怒等不良情绪，产生心理应激。本组试验采用慢性束缚法加冷水游泳法建立慢性疲劳综合征大鼠模型，结果提示，造模4周后模型组大鼠体质量、力竭游泳时间、穿格次数、直立次数显著减少(P<0.05)，提示慢性疲劳综合征大鼠模型复制成功。

慢性疲劳综合征属于中医学“虚劳”范畴[12]，其病机总属于气血阴阳亏虚[13-14]。炙甘草汤出自《伤寒论》，为治疗虚劳病之经典名方。方中炙甘草、生地益气养阴，人参大补元气，大枣、麦冬、阿胶、麻仁滋阴养血，生姜、桂枝温阳益气，诸药合用，共奏益气养血、滋阴复脉之功效[15]。本试验发现，造模成功后慢性疲劳综合征大鼠给予药物灌胃2周后，炙甘草组大鼠体质量、力竭游泳时间、穿格次数、直立次数等显著高于模型组，血清IL-1β、IL-6水平显著降低，IL-2、IL-12水平明显升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。表明炙甘草汤可以降低代谢综合征大鼠血清IL-1β、IL-6水平，提高IL-2、IL-12水平，改善疲劳症状，发挥治疗慢性疲劳综合征的作用。

综上所述，炙甘草汤对治疗慢性疲劳综合征是有效的，可以改善疲劳症状，可能与其抑制血清IL-1β、IL-6的表达，促进IL-2、IL-12的表达有关。