迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC原核表达及免疫试验

张志强，杨　楠，李永慧，王洪彬，吴同垒，康元环，莘　余，史秋梅，高桂生，王春凤*

(1.河北省预防兽医学重点实验室/河北科技师范学院，河北秦皇岛 066004；2.秦皇岛第二医院，河北昌黎 066600；3.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118)

迟缓爱德华菌(Edwardsiellatarda)在水产养殖上危害严重，鱼类感染该菌后病死率高、易反复、免疫力低下，传统抗生素和化学药物疗效不确切，急需开发新型、高效、安全的防治方法[1-2]。疫苗使用在畜禽生产上的巨大成功给水产养殖提供诸多借鉴，多种水产疫苗被开发应用，展现良好前景。遗憾的是，目前迟缓爱德华菌疫苗的研制还远未满足生产需求。除此之外，迟缓爱德华菌可以引起人的多种类型感染[1]，近年来通过食源途径感染的报道不断增多，说明了本菌在公共卫生学方面的重要性[3]。

鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要结构蛋白之一，在细菌运动、黏附和侵染宿主过程中发挥重要作用[4]，是细菌的重要毒力因子[5]。研究发现，细菌鞭毛蛋白能够活化宿主免疫反应，起到疫苗佐剂的作用，进一步研究发现，鞭毛蛋白可以通过TLR5通路诱导炎症反应发生并促使树突状细胞成熟，该蛋白无论是与抗原混合还是融合表达，均表现出良好的免疫效果[6-7]。除此之外，鞭毛蛋白本身具有较强的免疫原性，具有一定的免疫保护力[5]。FliC是构成鞭毛丝的主要蛋白成分，是目前鞭毛研究的焦点蛋白，其生物学功能得到一定程度解析[8]。本研究以迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC作为研究对象，用原核表达方法获得大量纯化的FliC重组蛋白，并进一步用动物试验评估该重组蛋白的免疫原性和对于模型动物的保护力，为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点的选择奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1菌株、质粒与实验动物致病性迟缓爱德华菌ET-13分离株由东南大学高大庆教授惠赠；迟缓爱德华菌阳性血清、原核表达载体pET-32a、禽呼肠病毒sigmaC蛋白，由河北科技师范学院动物传染病研究室保存；6周龄～8周龄清洁级昆明小鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所，试验前自由采食1周，以适应环境。

1.1.2酶及其他试剂LATaqDNA 聚合酶，宝生物工程(大连)有限公司产品；限制性内切酶及T4连接酶，Thermo公司产品；His标签单克隆抗体(His-MAb)、HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体(HRP-IgG)、IPTG及Ni+argose填料，康维世纪公司产品；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，Sigma公司产品；大肠埃希菌DH5α、BL21感受态细胞，全式金公司产品；基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒，OMEGA公司产品。

1.2　方法

1.2.1fliC基因克隆根据GenBank上公布的迟缓爱德华菌参考菌株ET-1基因组序列(CP001135.1)设计特异性引物扩增fliC基因。引物P1：5′-ATGGCACAAGTAATTAATACC-3′；引物P2：5′-ACGCAGCAGAGACAGGACG-3′。

用OMEGA基因组提取试剂盒提取fliC基因组，并以其为模板PCR扩增目的基因。回收目的基因，连接PMD18-T载体，连接产物转化入大肠埃希菌DH5α感受态细胞。挑取单菌落进行PCR检测，阳性菌落送由生工生物工程(北京)股份有限公司测序。在GenBank中下载爱德华氏菌参考株及肠杆菌科其他成员菌株目的基因序列，分析目的基因的保守性。

1.2.2重组原核表达载体的构建根据测序结果设计特异性扩增引物：P3：5′-CGGGATCCATGGCACAAGTAATTAATACC-3′，带有BamHⅠ酶切位点；P4：5′-GCGTCGACACGCAGCAGAGACAGGACG-3′，带有SalⅠ酶切位点。

测序结果正确的菌株扩大培养，提取质粒，以pMD18-T-fliC为模板，扩增目的基因并回收。用BamHⅠ和SalⅠ分别对纯化目的基因和pET-32a载体进行双酶切，回收后按照3∶1比例连接，转入大肠埃希菌DH5α感受态细胞中。挑取克隆进行PCR验证，阳性克隆提取质粒进行双酶切验证和序列测定，无突变和移码即得到重组表达载体pET-32a-fliC。

1.2.3His-FliC蛋白的原核表达将重组载体pET-32a-fliC和空载体分别转化入BL21工程菌中，挑取单菌落接种含有氨苄青霉素(50 μg/L)的液体LB培养基中，37℃振荡培养至对数期，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，诱导表达5 h。离心收集菌体沉淀，PBS缓冲液洗涤3次；加入蛋白上样缓冲液，充分混匀后煮沸10 min，离心，收集上清液即为蛋白样品，利用SDS-PAGE鉴定；His-MAb为一抗，HRP-IgG为二抗，分别用50 g/L脱脂奶粉按1∶1 000和1∶5 000稀释，用Western blot方法进一步确认目的蛋白表达。

1.2.4重组蛋白的可溶性分析及纯化将表达目的蛋白菌株按照上述条件进行扩大培养，离心收集菌体；用超声破碎仪破碎菌体，离心分离沉淀、上清，将细菌裂解物、上清以及沉淀分别制备蛋白样品，SDS-PAGE分析目的蛋白在三部分中的含量。本研究中重组FliC蛋白为部分上清表达，利用Ni2+亲和层析方法对上清蛋白进行纯化，获得较高纯度的蛋白，用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定纯化蛋白浓度，于-70℃保存。

1.2.5免疫小鼠血清抗体水平的检测将40只健康昆明小鼠随机分成2组，每组20只。以纯化的His-FliC蛋白作为免疫原，首免肌肉注射30 μg重组FliC蛋白(弗氏完全佐剂乳化)，间隔2周后二免(弗氏不完全佐剂乳化)，30 d后以弗氏不完全佐剂乳化蛋白加强免疫；对照组小鼠3免疫均注射等体积的PBS(加对应佐剂)。参照文献[9]小鼠免疫后不同时间点，尾尖采取小鼠血液并分离血清，以纯化的重组FliC蛋白作为包被抗原，利用间接ELISA方法检测小鼠血清中抗体的效价，以阴性血清OD 450 nm平均值加3倍标准差作为阴阳性判定标准。

1.2.6重组FliC蛋白免疫保护试验于第48天对上述两组小鼠腹腔接种迟缓爱德华菌ET-13菌液，剂量为5LD50(2.0×107CFU)，感染后观察4 d，统计死亡数量。

1.2.7迟缓爱德华菌FliC蛋白作为佐剂效果评估参照文献方法[10]，将40只健康昆明鼠随机分成4组，每组10只。以购买的牛血清白蛋白(BSA)作为评估蛋白，设置BSA免疫组、BSA+FliC蛋白免疫组以及BSA+弗氏佐剂免疫组，同时设立PBS组作为对照。免疫途径为皮下注射，免疫分两次进行，首免后间隔10 d进行二免，蛋白免疫剂量均为100 μg/只。

BSA蛋白油乳剂免疫组首免加完全福氏佐剂，二免加不完全福氏佐剂进行免疫，空白对照组以PBS替代。各免疫组在免疫后第 0、10、20、30天尾尖采血，进行小鼠血清抗BSA抗体效价检测。

2　结果

2.1　fliC基因克隆与重组表达载体pET-32a-fliC的构建

用PCR方法扩增出完整的fliC基因，并将其克隆到pMD18-T载体上，由生物公司测序，将测序结果与E.tarda其他菌株fliC基因参考序列比对分析显示爱德华菌属成员间fliC基因高度保守。用fliC基因的特异性扩增引物通过PCR方法，获得大小为1 248 bp的目的片段(图1)，将目的基因与原核表达载体pET-32a连接构建重组表达载体。

2.2　融合蛋白His-FliC的表达验证

将重组载体pET-32a-fliC转至表达工程菌 BL21中诱导表达重组蛋白，收集的菌体制备蛋白样品，进行SDS-PAGE验证，如图2A所示在60 ku处诱导表达出目的蛋白，分别以His-Mab、HRP-IgG为一抗和二抗进行Western blot分析，同样于60 ku处出现目的条带(图2B)，证明His-FliC重组蛋白能够表达。

M.DNA标准DL 2 000；1.fliC基因M.DNA Marker DL 2 000；1.fliC gene

2.3　His-FliC表达的可溶性分析及纯化

将能够表达目的蛋白的工程菌株扩大培养并诱导表达目的蛋白，收集菌体并对其超声裂解后在上清和沉淀中检测到目的蛋白(图3A)。取诱导表达上清进行纯化，在60 ku处纯化出His-FliC (图3B)，测定蛋白浓度为0.36 mg/mL。

2.4　多抗血清识别E.tarda鞭毛FliC蛋白效果验证

用Western blot分析发现，E.tarda感染小鼠阳性血清可以特异性识别重组His-FliC蛋白(图4A)。

将重组蛋白免疫小鼠，并于3免后15 d对所有组小鼠以5 LD50E.tarda活菌进行腹腔攻毒，120 h内观察并记录每组小鼠的死亡情况。结果显示，对照组小鼠全部死亡，免疫组小鼠死亡6只，其余小鼠在经历短暂精神沉郁、不食后逐渐恢复健康。图4B结果表明，His-FliC重组蛋白免疫小鼠后具有一定保护力，保护率为70%。

A.SDS-PAGE分析His-FliC在大肠埃希菌中的表达； B.Western blot分析His-FliC在大肠埃希菌中的表达

M.蛋白分子质量标准;1.pET-32a-FliC/BL21重组菌株; 2.pET-32a/BL21空载体菌株对照

A.SDS-PAGE analysis of His-FliC expression inE.coliBL21;B.Western blot analysis of His-FliC expression inE.coliBL21

M.Protein molecular weight Marker;1.pET-32a-FliC/BL21;2.pET-32a/BL21

图2His-FliC蛋白原核表达的验证

Fig.2Confirmation of prokaryotic expression of His-FliC

A.SDS-PAGE分析大肠埃希菌表达His-FliC的可溶性； B.SDS-PAGE分析His-FliC的纯化效果

M.蛋白分子质量标准;1.菌体裂解物; 2.菌体裂解物上清;3.菌体裂解物沉淀;4.纯化的 His-FliC蛋白

A.SDS-PAGE analysis of soluble His-FliC expression inE.coliBL21;B.SDS-PAGE analysis of His-FliC purification

M.Protein molecular weight Marker;1.Lysate of induced pET-32a-FliC/BL21;2.Supernatant of bacterial lysate;3.Precipitate of bacterial lysate;4.Purified protein His-FliC

图3His-FliC蛋白的纯化

Fig.3Purification of His-FliC

A.Western blot分析阳性血清对His-FliC蛋白的识别；B.His-FliC蛋白对小鼠的免疫保护效果

1.His-FliC重组蛋白;2.禽呼肠病毒His-sigmaC重组蛋白

A.His-FliC recognized by anti-E.tardapolyclonal antibody by Western blot analysis;B.Immune-protective potency of His-FliC in mice

1.His-FliC protein;2.His-sigmaC protein of avian reovirus

图4His-FliC蛋白对小鼠免疫保护力

Fig.4Immunoprotection of the mice againstE.tarda

2.5　免疫小鼠血清抗体水平的检测结果

将 FliC免疫小鼠4次采集的血清按1∶100进行稀释，以500 ng/mL重组蛋白包被酶标板，以羊抗鼠IgG-HRP为二抗进行间接ELISA检测(图5A)。结果表明，重组蛋白免疫小鼠能够产生较高水平特异性抗体，在加强免疫后达到最高水平。

将不同佐剂+BSA免疫小鼠4次采集的血清按1∶100进行稀释，以500 ng/mL BSA蛋白包被酶标板，以羊抗鼠IgG-HRP 为二抗进行间接 ELISA 检测(图5B)。结果表明，单纯BSA免疫小鼠几乎不产生特异性抗体，FliC混合BSA免疫能够刺激机体产生较高水平BSA的特异性抗体，虽不及弗氏佐剂组抗体水平高，依然证明了迟缓爱德华菌FliC蛋白的佐剂特性。

A.His-FliC免疫小鼠后，抗FliC抗体效价监测测；B.不同佐剂免疫下BSA抗体效价监测A.The specific antibody levels in mice induced by His-FliC;B.The specific antibody levels in mice induced by BSA with different adjuvant

3　讨论

迟缓爱德华菌是一种重要的水产病原菌，广泛引起多种海水鱼类、淡水鱼类感染发病，危害重大，尚无安全高效防控手段[11]。疫苗接种是规模化养殖防控疫病的重要手段，但目前迟缓爱德华菌疫苗的研究和使用还比较局限[12]。

鞭毛是细菌重要的附属元件，在细菌运动、黏附宿主细胞及生物被膜形成过程中发挥重要作用[8]。有研究表明鞭毛蛋白可以参与刺激宿主产生免疫反应过程，兼具免疫保护性和佐剂特性，具有广泛的应用前景。本研究尝试对迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC进行原核表达并进一步对其相关特性进行研究。对鼠伤寒沙门菌研究发现，其鞭毛蛋白具有良好的免疫原性，可以直接刺激机体强烈的免疫保护反应，是沙门菌的重要保护性抗原。本研究以Western blot方法检测发现，迟缓爱德华菌感染小鼠血清能够识别原核表达的鞭毛蛋白FliC蛋白，证明迟缓爱德华菌感染过程中鞭毛蛋白能够激发免疫反应，可能是一个保护性抗原。进一步研究发现，纯化的鞭毛蛋白FliC免疫小鼠，能够刺激机体产生高效价的血清抗体，而攻毒试验结果表明FliC蛋白可以在一定程度上保护小鼠抵御迟缓爱德华菌感染，揭示迟缓爱德华菌的鞭毛蛋白是重要的保护性抗原。当前，关于鞭毛蛋白研究的热点是其作为疫苗佐剂的应用。一方面鞭毛蛋白是TLR5受体的配体，可以通过激活NF-κB信号通路调控下游细胞因子表达，活化炎症反应[6]。另一方面细菌鞭毛蛋白可以促进树突状细胞成熟增加抗原的递呈效率，对机体免疫应答起到增强作用[13]。鞭毛蛋白的佐剂特性已被证实，无论将鞭毛蛋白与其他蛋白混合免疫或是将鞭毛蛋白和其他蛋白融合表达均能起到免疫佐剂效果，鞭毛蛋白的应用前景十分广阔[10]。本研究用迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC与牛血清白蛋白BSA混合免疫小鼠，结果显示，与单纯BSA免疫组比较，FliC蛋白混合免疫组小鼠表现出较高BSA血清抗体滴度，证实迟缓爱德华菌FliC蛋白的佐剂特性，而FliC蛋白混合免疫组小鼠血清效价明显低于弗氏佐剂组，也表明FliC蛋白作为佐剂应用还不够成熟，还有相当长的路要走。当然，本研究还存在诸多不完善之处，如缺乏对细胞免疫的评估，对FliC蛋白佐剂特性研究只是基于抗体效价检测，缺乏细胞因子水平检测、信号通路研究等,对此，本课题组将于未来继续完善。本项研究为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位苗和活载体疫苗提供了参考。