猪瘟病毒在猪体组织中的分布

张秋雨，李　鹏，陈　晴，任鹏举，银　梅*，王选年*

(1.河南科技学院动物科技学院，河南新乡 453003；2.新乡学院生物技术研究中心/生命科学与技术学院，河南新乡 453003；3.郑州大学生命科学学院，河南郑州 450000)

猪瘟(Classical swine fever，CSF)俗称“烂肠瘟”,是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种急性、高度接触性传染病,临床上以高热稽留、精神极度沉郁及黏膜广泛性出血等为主要特征。CSF呈世界范围分布,不同的国家其流行程度也有差异,其发病率和病死率很高,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物传染病,并将该病列为国际重点检疫对象[1]。

目前,国内外对CSF的诊断方法有传统的病毒分离鉴定、免疫荧光试验、猪体回归感染试验、血清学诊断及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)等。这些方法都有各自的缺陷与不足,均不能满足当前疾病诊断的需求及对样品中病毒含量进行高灵敏度分析的要求[2-6]。而TaqMan qPCR是在常规PCR基础上发展起来的一种核酸扩增技术,增加一个特定的水解探针,具有特异性强、敏感性高和重复性好等优势,已经被广泛用于动物检疫和食品行业等病原体的检测,可以对样品中的病毒载量实现真正的动态定量[7]。CSFV属于黄病毒科瘟病毒属的成员,具有囊膜,病毒粒子的基因组为单股正链的RNA,其大小为12.3 kb,包含一个开放阅读框(open reading frame,ORF),两端的非编码区(untranslated region,UTR)高度保守。E0蛋白是一种病毒吸附蛋白,是CSFV最重要的糖蛋白之一。据相关文献报道[8],E0蛋白具有RNA酶的活性,在细胞中的表达、复制和调控机制等方面发挥重要作用。同时,国际上常常把E0基因作为是否感染CSFV的检测依据。E0蛋白在该病的防控和致病过程中发挥极其重要的关键作用[9]，它可以刺激机体产生免疫反应,以阻断CSFV对机体的感染。当猪感染CSFV后,其结构糖蛋白E0可以刺激机体产生中和抗体,具有较强的免疫相关性,因而把E0基因的作为检测的标记物具有重要的意义[10]。

本研究是以规模化养猪场遇到的一例典型的CSF病例,剖检后进行病毒的分离鉴定。同时,以CSFV相对保守的E0基因设计1对引物和探针,建立一种特异、快速和准确的CSFVTaqMan qPCR检测方法,并检测CSFV在猪体内组织中的定量分布情况。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1病毒的基因组、质粒及试剂CSFV标准株(cDNA)、猪细小病毒(cDNA)、猪圆环病毒(DNA)、猪流行性腹泻病毒(cDNA)、pMD19-T-E0质粒，均由河南科技学院动物科技学院实验室保存；2×ESTaqMasterMix、RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、反转录试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品。

1.1.2病料及实验动物河南新乡辉县某种猪场1头疑似感染猪瘟病毒急性发病死亡的猪尸体；新西兰兔(2 kg左右)，购自华兰生物疫苗有限公司实验动物中心。

1.2　方法

1.2.1引物的设计与合成参考GenBank公布的CSFV E0基因(登录号：KY816734.1)的相对保守核苷酸序列,根据TaqMan实时荧光定量PCR引物设计原则,利用Preimer5.0引物设计软件分别设计2对引物和探针(表1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1　RT-PCR及TaqMan qPCR引物和探针信息

1.2.2实验室诊断

1.2.2.1病猪剖检 对病死猪尸体进行剖检，并无菌取出病猪的心脏、肝脏、淋巴结、肾脏、脾脏、血液和肠道等组织器官送实验室待检。

1.2.2.2RT-PCR按照Trizol kit试剂盒说明书,从病变的组织样品中提取RNA,并逆转录为cDNA,作为PCR的模板。PCR反应体系为20 μL：ddH2O 8.2 μL,上、下游引物E0 F1、E0 R1各0.3 μL,模板1.5 μL,2×ESTaqMasterMix 10 μL; PCR反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 40 s，58 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,循环35次;最后进行72 ℃ 10 min。PCR扩增产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果,胶回收产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.2.2.3免疫交互试验将猪尸体的淋巴结和脾脏充分剪碎研磨后，用无菌的生理盐水按1∶5稀释，5 000 r/min离心10 min后取上清,取2只健康且体重接近的家兔,按4 mL/只进行肌肉注射,另外取2只家兔注射生理盐水作为对照组。1周后对上述4只家兔耳缘静脉注射1∶10的猪瘟兔化弱毒(0.5 mL/只),24 h后,每间隔6 h测定1次体温,共测16次。在攻毒后,对照组2/3以上不出现定型热或轻型热，则表明免疫交互试验成立，结果判定标准见表2。

1.2.3TaqMan荧光定量PCR标准曲线的建立将重组质粒pMD19-T-E0，梯度稀释为1010～103拷贝/μL作为标准品(模板)，进行TaqMan qPCR。通过前期的预试验对TaqMan荧光定量PCR的反应条件和参数进行了优化,确定其最优的反应体系为10 μL：2×PCR Master Mix 5 μL，上、下游引物E0 F2和E0 R2各0.2 μL,探针0.2 μL,模板1 μL,ddH2O 3.4 μL;最佳反应程序为：95℃ 5 min；94℃ 15 s,58℃ 30 s,72℃ 10 s,同时捕捉FAM信号,进行40个循环,软件自动生成动力学曲线和熔解曲线,并建立标准曲线。

表2　诊断CSF的兔体交互试验判定标准

注：+：有发热；-：无发热。

Note：+：Fever；-：No fever.

1.2.4TaqMan实时荧光定量PCR的特异性和重复性分析以CSFV石门株、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)等病毒的DNA或cDNA为模板,同时用水作为空白对照,进行TaqMan实时荧光定量PCR检测,并根据荧光信号的变化判断其特异性。按照上述建立的TaqMan实时荧光定量PCR的反应条件和体系,以107拷贝/μL～105拷贝/μL重组质粒为模板,分别进行批内和批间重复性试验,对稀释的每一个拷贝数进行3个平行重复试验,验证其稳定性。并根据实时荧光定量PCR扩增的标准“S”形曲线而变化的荧光信号强度,求出Ct值,然后把Ct值带入标准曲线计算出该样品检测的起始浓度。用统计学软件计算其变异系数(CV)。

1.2.5TaqMan实时荧光定量PCR检测CSFV在组织中的分布病死猪剖检后,采集各部位的病料,包括心脏、肝脏、淋巴结、肾脏、脾脏、血液及肠道等器官和组织。按照RNA提取试剂盒的操作说明提取各样品的RNA,并反转录为cDNA,用TaqMan实时荧光定量PCR检测各样品中病毒含量的分布。每个样品进行3个平行试验,同时设置标准曲线。

2　结果

2.1　病理变化

剖检的主要病理变化为眼结膜潮红,腹部、臀部、耳部、颈部和四肢内侧等皮肤出现暗紫色斑且全身弥漫性出血和坏死(图1A)；皮下组织有弥漫性出血点,血液凝固不良(图1B)；脾脏边缘有多个较硬的出血梗死,呈黑色,大小不一；心肌外膜出血；肺脏有散在的出血病变和轻微的梗死(图1C)；可见肾脏表面苍白有针尖状的出血点或大的出血斑(图1D)，出血部位以皮质表面多见,呈现典型的“雀斑肾”外观,其皮质和髓质区域有严重的多量点状出血,水肿,呈红黄色,肾盂黏膜有严重的弥漫性出血(图1E,图1F)；肠道浆膜和回盲口处有小的点状出血斑,大肠黏膜上形成近似圆形的纽扣状溃疡灶(图1G)；胃黏膜有出血(图1H)；肋骨和肋骨膜有严重的出血斑点病变，肋骨近端到肋软骨交界部位有明显的骨化线(图1I)。

2.2　RT-PCR扩增

以CSFV的cDNA为模板对E0基因进行扩增,其产物经凝胶电泳显示其条带大小为626 bp(图2),阴性对照扩增后无条带。测序结果与GenBank中公布的E0基因的标准序列(GenBank登录号：KY816734.1)经BLAST比对,核苷酸序列的同源性为100%。

图1　疑似CSF病猪剖检后的大体病变

M.DNA标准DL 1 000；1.阴性对照；2～8.检测样品分别为心脏、肝脏、血液、肾脏、脾脏、淋巴结和肠道组织

M.DNA Marker DL 1 000；1.Negative control；2-8.Samples form heart,liver,blood,kidney,spleen,lymph nodes and intestinal tissues

图2CSFV的RT-PCR检测结果

Fig.2RT-PCR detection results of CSFV

2.3　兔体交互试验

注射疫苗和病料后每隔6 h测量体温1次,连续测96 h(表3)。试验组的A号、B号家兔体温变化范围分别为39.5℃～41.9℃、39.6℃～41.3℃,温差1.7℃～2.4℃,说明试验组注射病料和免疫猪瘟兔化弱毒疫苗后均出现明显热型反应,则表明被检病料中含有CSFV强毒。而对照组的C号、D号家兔注射生理盐水后没有出现热型反应,表明整个试验成立。

表3　各组试验兔体温变化情况

2.4　TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线的建立

以1010拷贝/μL～103拷贝/μL的标准质粒作为TaqMan qPCR的模板,扩增反应结束后,其扩增曲线见图3A,得到的熔解曲线较好,只出现整齐单一的特异性峰,没有引物二聚体现象(图3B),软件自动生成标准曲线见图3C,其扩增效率为99.76%,标准品的浓度与Ct值呈现良好的线性关系,相关系数(R2)值为0.998 9,标准曲线的回归方程为y=-3.295x+8.96。

2.5　TaqMan实时荧光定量PCR的特异性

以CSFV标准株(cDNA)、猪细小病毒(cDNA)、猪圆环病毒(DNA)和猪流行性腹泻病毒(cDNA)等样品作为模板,采用本实验室已经建立的CSFV E0基因的TaqMan实时荧光定量PCR进行扩增。结果表明，只有CSFV标准株出现单一、特异性的“S”形曲线(图4),而其他阴性对照没有检测出阳性峰值信号。

2.6　TaqMan荧光定量PCR方法的重复性

以3个不同的浓度梯度的重组质粒作为模板，用TaqMan qPCR进行检测，其组间和组内的重复性试验结果的Ct值和变异系数见表4,该方法的批内变异系数为0.14%～1.62%,批间变异系数为0.64%～1.52%,其变异系数均小于2%，表明该方法不但具有良好的重现性,而且稳定性也比较好,其中阴性对照(N)没有检测到荧光信号，无扩增曲线产生。

2.7　检测临床样品中CSFV在组织中的分布情况

以本实验室诊断由于急性感染CSFV死亡的猪,剖检后取体内各组织脏器,并分别提取RNA,逆转录为cDNA作为模板,进行TaqMan qPCR检测,从图5中可知E0基因的的扩增曲线良好,熔解曲线整齐单一，且没有其他杂峰出现。淋巴结中CSFV含量最高,其次为脾脏、肾脏、肠道组织、血液和心脏,肝脏中CSFV含量最低,对照组未检测出病毒RNA。

3　讨论

猪瘟是一种具有高度传染性的疾病,其传播快、流行广,多为混合感染,给我国养猪业造成了严重的经济损失。目前对于猪瘟的诊断方法有病毒分离鉴定、原位杂交、免疫组化、RT-PCR和RT-nPCR[7,11]等。但传统的检测方法十分繁琐,耗时长、成本较高,不适合大样本量的检测。而分子生物学方法中的RT-PCR容易引起交叉污染,且不能准确定量，实时荧光定量RT-PCR操作简单、灵敏度高、重复性好，可以对组织中的病毒进行定量分析等优势被广泛应用,但对于CSFV的早期感染的鉴别诊断还存在着许多缺陷。而TaqMan qPCR是在RT-PCR的基础上增加了一个TaqMan探针,该方法具有很高的特异性、敏感性和重复性，尤其是对于CSFV的早期临床诊断提供了一个较为可靠的工具。

A.标准质粒；B.熔解曲线；1～8.质粒浓度分别为1010拷贝/μL～103拷贝/μL；C.标准曲线

A.Standard plasmid；B.Dissolution curve;1-8.Plasmid concentrations were 1010-103copies/μL;C.Standard curve

图3以质粒为模板的TaqMan荧光定量PCR标准曲线

Fig.3Standard curves ofTaqMan fluorescent quantitative PCR with plasmid as template

1.CSFV cDNA;2.猪细小病毒cDNA;3、4.分别为猪圆环病毒DNA和猪流行性腹泻病毒cDNA；5.阴性对照

1.CSFVcDNA;2.Porcine parvovirus cDNA;3，4.Porcine circovirus cDNA and porcine epidemic diarrhea virus cDNA,respectively；5.Negative control

图4　TaqMan荧光定量PCR特异性检验动力学曲线

图5　TaqMan荧光定量PCR检测CSFV在组织中的分布

本试验通过对临床遇到的一例典型疑似猪瘟病死猪,通过大体病变、RT-PCR及兔体交互试验进行诊断,确定该病死猪由于感染CSFV而引起的急性死亡。但目前还没有完全了解CSFV感染机体后的病毒复制、增殖、分布、组织嗜性和传播特性等一系列问题。因此,为了更进一步了解CSFV侵入机体后在组织中分布和病猪死亡的相关性，本试验根据CSFV E0基因的相对保守核苷酸序列设计1对特异性引物和探针,建立了检测CSFV 的TaqMan qPCR方法,该方法只对CSFV cDNA有阳性扩增曲线,且重复性较好。而对猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)均没有阳性扩增信号，表明该方法的特异性强。本试验对遇到的典型临床死亡的猪瘟病例进行剖检后,对体内各组织器官中的病毒含量进行检测,结果显示，CSFV感染猪后其主要侵袭部位为淋巴结、心脏、血液、脾脏、肾脏和肠道等组织。在本次研究中也发现，血清中病毒含量也相对比较高,这可能是当猪感染CSFV急性死亡后,通过粪便和尿液向外界排毒,从而引起病毒可以通过全身传播进而对外界环境造成污染和传播疫病[12]。同时,这些检测结果也提示,CSFV存在于该死亡猪的全身各个组织器官及血液当中,可能是造成猪急性死亡的主要原因。

CSFV在淋巴组织和血液中的病毒载量几乎是最高的,同时,心脏、十二指肠、脑、胃和骨骼肌的病毒含量相对较低。一般认为,当猪感染CSFV后扁桃体是病毒载量最丰富的组织,而这次检测发现只有中等的病毒含量,这可能与动物的年龄、病毒毒力和剂量以及动物分娩前后等因素有关[13-15]。这与DiasN L等[16]应用TaqMan荧光定量PCR对145份病料的检测结果差别较大,这可能与病毒的地区性毒株有一定的关系。Woniakowski G等[17]用SYBR Green荧光定量PCR分析了CSFV感染猪后其血液和组织样品中的病毒含量；朱长康[18]通过人工感染CSFV,用病理组织学方法,检测各个脏器中CSFV载量，从而进一步研究CSFV在体内脏器的的动态分布、临床症状和组织嗜性的相关性。本试验的样品来自临床上由于感染猪瘟病毒后急性死亡的典型病猪作为研究对象,并利用建立的TaqMan qPCR检测了急性死亡病例中CSFV在不同器官和血液中的分布情况,为进一步开展CSFV的定量检测、综合防控和感染机制的研究奠定了基础。