奶牛场55例犊牛腹泻主要病原调查

代少华，李　超，2，李志骞，陆江一，王天宇，董　强*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.错那县觉拉乡人民政府，西藏错那 856700；3.陕西省畜牧产业试验示范中心，陕西泾阳 713702)

腹泻是导致犊牛生长发育障碍甚至死亡的主要疾病之一[1]，病因主要包括感染性因素、营养性因素和环境性因素。根据引起腹泻的致病因素的不同可将感染性腹泻分为细菌性腹泻、病毒性腹泻和寄生虫性腹泻3类[2]。营养性因素包括饲养管理不当，吃奶过多或吃了难以消化的饲料等造成犊牛腹泻；环境性因素为一年四季均可发生，尤其以春初、夏末、秋初为多发期；以出生3周龄内的犊牛易发性高。犊牛发生腹泻时的临床症状通常采食减少或废绝，精神沉郁，呕吐、脱水和体型消瘦，特征性临床症状为排出稀粪、水样粪或者软粪。如果不及时的诊断、治疗，则易导致机体抵抗力下降甚至死亡，给养殖场带来严重的经济损失[3-4]。本研究在2016年11月至2017年5月间，对1 478头奶牛，其中犊牛159头，进行腹泻及其病因情况调查。对其中的55例腹泻犊牛的血液和粪便中病原进行检测，为该地区的犊牛腹泻的防治提供基础资料。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1主要仪器与耗材50 mL离心管台式离心机，Sigma公司产品；低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂产品；全波长酶标仪，美国伯腾(BioTek)公司产品；一次性真空采血管(含肝素钠抗凝剂，不含抗凝剂两种)，浏阳市三力医用科技发展公司产品。

1.1.2主要试剂盒牛病毒性腹泻病毒抗原检测试剂盒，Idexx公司产品；犊牛腹泻抗原四联快速检测卡(隐孢子虫、轮状病毒、贾第虫和大肠埃希菌K99)(BioNote)，安捷(韩国)公司产品。

1.2　方法

1.2.1调查方法通过询问奶牛场兽医和犊牛腹泻发病的情况，包括牛群的数量、发病头数、临床症状、发病史、治疗药物和效果等，对患病犊牛进行样品采集。

1.2.2血液和粪便样品的采集血浆样品的来源：1号奶牛场35份犊牛血浆样品和2号奶牛场20份犊牛血浆样品，常温保存，迅速带回实验室离心备用。用含有肝素钠抗凝剂和不含抗凝剂的两种采血管对患病犊牛各采血10 mL，做好标记；3 000 r/min离心10 min，分别获得血浆和血清，置-20℃保存待测。粪便样品的来源：1号奶牛场35份犊牛粪便样品和2号奶牛场20份犊牛粪便样品，装于50 mL离心管中防止污染，常温保存备用。直肠采集新鲜粪便30 g，装于50 mL离心管中(粪样有形成分的破坏会导致病原菌死亡或腐生性原虫的污染，所以应避免粪样混有尿液、污水和消毒剂)。对样品做好标记。

1.2.3犊牛腹泻病原的检测采用Idexx公司牛病毒性腹泻病毒抗原检测试剂盒检测，具体操作过程参照试剂盒使用说明书；采用韩国安捷(BioNote)犊牛腹泻抗原四联快速检测卡检测寄生虫，具体操作过程参照试剂盒使用说明书。

1.2.4数据统计与分析数据采用Graphpad Prism 5分析软件进行分析，结果用平均值±标准差表示(n=3)，数据用t-test方法进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著。

2　结果

2.1　犊牛腹泻情况调查

1号奶牛场奶牛存栏478头，其中犊牛75头，平均每月发病5头，发病率为6.67%；2号奶牛场奶牛存栏1 000头，其中犊牛84头，平均每月发病4头，犊牛发病率为4.76%，总体发病率为5.66%(表1)。

表1　犊牛腹泻平均每月发病情况

2.2　牛病毒性腹泻病毒的检测结果

对1号奶牛场35份血浆样品检测，2号奶牛场20份血浆样品进行检测，结果均为阴性，未检出牛病毒性腹泻病毒(表2)。

表2　BVDV检测结果

2.3　轮状病毒、大肠埃希菌K99、贾第虫和隐孢子虫检测结果

对两个奶牛场总共55份(1号奶牛场35份，2号奶牛场20份)犊牛粪便样品分两批,使用犊牛腹泻抗原四联快速检测卡进行检测。1号奶牛场检测结果显示，轮状病毒阳性率20%，大肠埃希菌K99阳性率30%，隐孢子虫阳性率20%，贾第虫未检出；2号牛场检测结果显示，轮状病毒阳性率25%，隐孢子虫阳性率75%，贾第虫阳性率25%，大肠埃希菌K99未检出(表3)。

表3　奶牛场粪便样品检测结果

3　讨论

通过牛病毒性腹泻病毒抗原检测试剂盒和隐孢子球虫-牛轮状病毒-大肠埃希菌K99-贾第虫四联快速检测试剂盒对几个犊牛腹泻主要病因进行检测，结果显示，1号奶牛场(共35份犊牛粪样，35份犊牛血浆样品)检测结果为大肠埃希菌K99阳性率33%，隐孢子虫阳性率20%，轮状病毒阳性率20%，贾第虫和牛病毒性腹泻病毒均未检出，未出现死亡病例，存在2种病原的混合感染。可见该奶牛场表现为多种病因同时存在，无法判定某一种致病因素为主要病因，可能是由于犊牛抵抗力较弱导致各种腹泻病原的混合感染。因此，除了针对检测出已存在的致病因素对犊牛腹泻进行防控以外，加强饲养管理水平也是十分必要的。

2号奶牛场(共20份犊牛粪样，20份犊牛血浆样品)检测结果为隐孢子虫阳性率75%，轮状病毒阳性率25%，贾第虫阳性率25%，大肠埃希菌K99未检出，未出现死亡病例，存在2种病原的混合感染，未对病牛进行牛病毒性腹泻病毒的检测，该场同样表现为多种病原同时存在，但其中隐孢子虫感染情况最为严重，应引起养殖户的注意，隐孢子虫通过食物、水源以及直接或间接接触均能进行传播。根据该牛场的饲养管理来看，可能与水源的污染有关，但地下水被污染的原因还有待调查。因此，养殖场若要控制该病的发病率，应注意饮水卫生以及圈舍的消毒，隐孢子虫的卵囊多在晚间排出，所以应安排在清晨对病舍进行清扫消毒。隐孢子虫卵囊对外界的抵抗力较强，常规的消毒方法不能将其杀灭。但是用100 mL/L福尔马林、50 mL/L氨水或65℃以上30 min均可杀死卵囊。此外，含氯消毒剂对饮用水中的隐孢子虫具有良好的杀灭效果，杀灭率可大于99%[3]。轮状病毒和贾第虫阳性率虽不及隐孢子虫，但不能忽视其仍可能是造成犊牛腹泻的病因，需同样在防控工作上予以关注。

本次检测结果显示，病原的总体感染率由高到低依次为隐孢子虫35.7%、轮状病毒21.4%、大肠埃希菌K99 21.4%、贾第虫7.1%，牛病毒性腹泻病毒未检出。可以看出隐孢子虫的感染情况最为严重，应予以足够重视。本次调查未检出牛病毒性腹泻病毒，可初步认为牛病毒性腹泻病毒不是杨凌这2个奶牛场犊牛腹泻的主要原因。根据调查结果2个奶牛场均在犊牛出生后1 h内灌喂4 L经产牛初乳，100%犊牛在1 h内饲喂初乳；初乳灌喂4 h后进行常乳饲喂，1日3次，调查过程中未见其他异常[5]；可排除因初乳饲喂不足或不及时所导致的营养性因素引起的腹泻。

本次调查虽然在腹泻病牛样品中检测到一些病原，但仍有一部分样品未检测到病原。造成该情况的原因可能是实验室检测病原的种类有限，未检测到真正的致腹泻病原；也有可能是样品在保存过程中一些病原遭到破坏，导致未被检出。今后可对杨凌周边其他奶牛场进行采样检测，扩大检测样本数量，并增加病原检测种类，比如沙门菌、球虫等，从而提高结果的可参考性和可引用性。