犬圆环病毒Rep蛋白的原核表达

汪　伟，孙文超，曹　亮，易驰喆，郑　敏，鲁会军*，金宁一*

(1.军事兽医研究所，吉林长春 130122；2.温州大学病毒学研究所，浙江温州 325035；3.广西动物疫病预防控制中心，广西南宁 530001)

犬圆环病毒(Canine circovirus，CanineCV)在分类学上属于环状病毒科(Circoviridae)环状病毒属(Circovirus)的成员，为无囊膜的单股环状DNA 病毒，基因组的大小约为2063 bp。CaineCV基因组包括两个主要的编码框，分别编码复制酶(Rep)蛋白和核衣壳(Cap)蛋白。CaineCV于2012年首次被报道后[1]，陆续在意大利和德国发现[2]。已有病例报道称CaineCV是引起犬淋巴结肉芽肿和坏死性血管炎的致病因子，临床症状主要表现为呕吐、出血性腹泻等[2]。目前，欧美各国均已经对CaineCV开展相关研究，而我国对该病毒的研究比较滞后。2016年孙文超等[3-4]对我国CaineCV的流行状况进行了首次报道。CanineCV 的ORF1编码框全长912 bp，编码由303个氨基酸组成的复制酶(Rep蛋白)，Rep蛋白主要参与病毒的复制，但对其功能和作用机制尚不明确。为了对CaineCV 的Rep蛋白进行深入研究，本研究以犬圆环病毒基因组为模板序列，设计了特异性引物，通过PCR 扩增出Rep基因的完整序列，连接至pET-28a载体上，通过大肠埃希菌原核表达系统表达Rep蛋白，为制备Rep蛋白的亚单位疫苗和建立CanineCV的ELISA 检测方法奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材料

大肠埃希菌BL21、DH5α感受态细胞，2×TaqPCR MasterMix，TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒，均购自天根生化科技有限公司；蛋白胨、酵母粉、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素等，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD18-T载体，购自宝生物工程(大连)有限公司；CanineCV JZ98/2014毒株、pET-28a质粒，本实验保存。

1.2　方法

1.2.1引物设计以GenBank中收录的CanineCV JZ98/2014毒株序列(登录号：KT946839)为参考序列，设计引物扩增Rep基因的特异性引物。上游引物F(BamHⅠ)：5′-GCGGGATCCATGGCTCAAGCTCAGGTTGA-3′；下游引物R(XhoI)：5′- CCCTCGAGGTAGTTATACATGAAAGGGAAC -3′，目的片段大小为912 bp，引物序列由吉林库美生物有限公司合成。

1.2.2基因组样品的制备参照TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒说明书提取病毒基因组。

1.2.3PCR反应及基因克隆以提取的基因组样品为模板进行PCR 。反应条件：95℃预变性3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共30个循环；最后72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，回收纯化后连入pMD18-T载体，4℃ 连接过夜。连接产物转化大肠埃希菌DH-5α感受态细胞，37℃ 摇床培养45 min 后，涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上培养13 h。从平板上挑取单菌落至含氨苄青霉素的LB 液体培养基中培养12 h，少量提取质粒后用XhoⅠ和BamHⅠ酶切鉴定，酶切结果正确样品送吉林库美生物有限公司测序。

1.2.4原核表达载体的构建将测序正确的阳性质粒及pET-28a原核表达载体分别经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，4℃ 连接过夜。连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，涂布在含有卡那霉素的LB 平板上培养13 h。从平板上挑取单菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中培养12 h，少量摇菌后小提，质粒双酶切鉴定后送吉林库美生物有限公司测序，将测序正确的阳性质粒命名为pET(28a)-Rep。

1.2.5重组蛋白的原核表达将pET(28a)-Rep 质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞后，涂布在含有卡那霉素的LB平板上培养14 h 。从平板上挑取单菌落至含有卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养12 h，保存至4℃冰箱作为母液备用。将母液按1∶500的比例接种到新鲜培养液中，培养至OD 600 nm值在0.4～0.8之间，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，继续培养6 h后收取样品。样品加入buffer沸水浴5 min，SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色鉴定诱导表达产物。

1.2.6Wstern blot鉴定诱导表达产物SDS-PAGE 电泳后，凝胶通过半干转膜仪将蛋白转移至PVDF膜上，用含50 mL/L小牛血清的脱脂乳封闭2 h后，加入鼠源Anti-His标签抗体孵育2 h后TBST洗3次，加入HPR 标记的羊抗鼠二抗孵育2 h后TBST洗3次，AEC显色。

2　结果

2.1　Rep基因的PCR扩增

以CanineCV基因组作为模板，PCR扩增出Rep基因的全长序列，条带大小约为900 bp，与预期相符。将目的条带连接在pMD18-T载体上后送测序，将测序正确的阳性质粒命名为T-Rep (图1)。

2.2　重组质粒的构建

将T-Rep质粒以及pET-28a载体分别经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后，琼脂糖电泳鉴定正确。胶回收纯化后4℃连接过夜，连接产物转化大肠埃希菌DH5α。将菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上，培养12 h后挑菌。挑取单菌落用液体LB培养12 h后小提，双酶切鉴定为阳性。测序结果显示目的基因已正确连接在pET-28a载体上，将测序正确的阳性质粒命名为pET(28a)-Rep(图2)。

M.DNA 标准DL 2 000;1.基因组样品；2.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000;1.Genomic sample;2.Nagetive control

图1Rep基因的PCR扩增

Fig.1PCR amplification of Rep gene

M.DNA 标准DL 2 000;1.质粒

M.DNA Marker DL 2 000;1.Plasmids

图2pET(28a)-Rep质粒双酶切鉴定

Fig.2Idetification of pET(28a)-Rep plasmids by double enzyme digestion

2.3　原核表达产物的鉴定

在转有重组质粒pET(28a)-Rep的大肠埃希菌BL21感受态细胞中加入终浓度0.5 mmol/L IPTG，置于37℃恒温摇床培养，7 h后取样进行SDS-PAGE电泳。将菌液超声裂解，取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析鉴定，通过与空载体和0 h的诱导产物对比，发现转有pET(28a)-Rep质粒的重组菌能正确表达带有His标签的Rep蛋白，条带大小约为35 ku，与预期相符。重组蛋白主要集中在沉淀中，表明重组蛋白主要以包涵体的形式表达(图3)。

2.4　原核表达产物的Wstern blot鉴定

在SDS-PAGE电泳后，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上后，用Anti-His标签抗体检测带有His标签的重组Rep蛋白的反应原性。结果表明重组菌的表达产物能与Anti-His标签抗体发生特异性结合，表明带有His标签的重组Rep蛋白得到正确表达(图4)。

M.蛋白分子质量标准;1.pET-28a诱导前产物； 2.pET-28a诱导后产物；3.重组菌诱导产物沉淀； 4.重组菌诱导产物上清

M.Protein molecular weight Marker;1.pET-28a pre-induced products;2.pET-28a induced products;3.Precipitate of the recombinant bacteria induced products;4.Supernatant of the recombinant bacteria induced products

图3重组Rep蛋白表达形式分析

Fig.3SDS-PAGE analysis of recombinant Rep proteins

M.蛋白分子质量标准;1.pET-28a诱导前产物；2.pET-28a诱导后产物；3.重组菌诱导前产物；4.重组菌诱导后产物

M.Protein molecular weight Marker;1.pET-28a pre-induced products;2.pET-28a induced products;3.Recombinant bacteria pre-induced products;4.Recombinant bacteria induced products

图4重组Rep蛋白Western blot鉴定

Fig.4Identification of recombinant Rep protein by Western blot

3　讨论

自2012年Kapoor等首次报道犬圆环病毒以来，欧美各国陆续发现并报道了CanineCV并开展了相关研究，而我国一直未见相关报道。直到2016年，孙文超等人首次从犬血清中样品检测出CanineCV病毒，遗传进化分析表明我国发现的CanineCV毒株与欧美各国发现的毒株位于不同的进化分支。Li L等[5]从感染犬细小病毒的病犬粪便样品中用RT-qPCR方法成功检测到CanineCV病毒，进一步研究表明感染CanineCV可引起病犬淋巴肉芽肿、坏死性血管炎以及出血性腹泻等临床症状，但目前尚无直接证据表明CanineCV能独立引发上述临床症状。Decaro N等[2]通过病理学剖检和电镜检查发现，CanineCV与圆环病毒属的其他成员相似，均以淋巴细胞为主要侵害细胞[6]。已报道的CanineCV的基因组长度均为2 063 bp，包含有3个阅读框，其中含有912 bp 碱基最大的阅读框ORF1编码病毒的Rep蛋白，其分子量大小约为33 ku，目前的研究表明，Rep蛋白主要与病毒的复制有关，但Rep蛋白的具体功能和作用机制有待进一步研究。

已有研究表明Rep蛋白较为保守，通过对猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白的功能的分析，可作为研究CanineCV Rep蛋白功能及作用机制的参考。在PCV2上的研究表明Rep蛋白是由PCV2基因组的最大编码框ORF1 编码，在病毒转录过程中ORF1转录本mRNA第417-799 nt 处发生了剪接，产生了一个截断的Rep' 蛋白，两者在病毒的复制过程中发挥协同作用[7-8]。两种蛋白的N端序列中含有与CanineCV 滚环复制相关的3个保守序列Ⅰ(FTLUI)、Ⅱ(HLQG)、Ⅲ(YCSK) 以及1个结合dNTPs的P环结构，这些序列的缺失或突变均会影响病毒的增殖。Cheung A K等[9-10]研究表明Rep和Rep'与细胞核中的dsDNA复制原点结合后， 使其颈环结构展开，暴露出九聚体序列，随后Rep/Rep'识别并切割该序列，以滚环方式进行基因组复制。对PCV2 Rep启动子区类干扰素刺激反应元件(vISRE)进行点突变，发现突变株增殖能力相对亲本株大幅度下降和对干扰素刺激的反应，这表明Rep启动区域vISRE可能在干扰素促进病毒增殖过程中发挥调控作用[11]。张鑫[12]通过构建Cap蛋白和Rep蛋白的真核表达质粒，通过共转染发现Cap蛋白和Rep蛋白存在共定位现象，推测Rep蛋白与Cap蛋白在病毒复制过程发挥协同用。目前在PCV2上的研究表明，PCV2感染后可以诱导Cap蛋白和Rep蛋白的产生，其中Cap蛋白包含主要的抗原中和表位，具有良好的免疫原性，但是存在体外表达难度大、表达量低的缺点，其次针对PCV2的疫苗产生的抗体主要针对Cap蛋白，不利于临床检测区分疫苗免疫与自然感染之间的鉴别诊断问题。现有的研究表明Rep蛋白也可以诱导中和抗体的产生，且可以在体外高效表达。Rep蛋白的这些特点有利于研制针对Rep蛋白的亚单位疫苗和ELISA检测试剂盒[13-14]。

自2012年首次报道CanineCV后，欧美各国已逐步开展对CanineCV的研究，然而至今对其临床症状、病理特征、致病机制及检测手段尚无明确报道。本试验以CanineCV基因组为模板，成功扩增出病毒的Rep蛋白序列，并将其连接在pET-28a载体上，构建了原核表达质粒pET(28a)-Rep。SDS-PAGE和Western blot鉴定结果表明带有His标签的重组Rep蛋白能以包涵体的形式在重组菌中获得高效表达。该重组蛋白可用于制备Rep蛋白的抗体，为制备CanineCV的ELISA检测试剂盒及CanineCV的防控奠定了基础。