TGF-β通路与哺乳动物卵母细胞发育研究进展

牛慧敏，王丽丽，张俊玉，吕　珊，尚江华，雷安民*

(1.西北农林科技大学动物医学院/陕西省干细胞工程技术研究中心，陕西杨凌 712100；2.农业部(广西)水牛遗传繁育重点试验室/中国农业科学院广西水牛研究所，广西南宁 530001)

哺乳动物的原始生殖细胞出现于早期胚胎内胚层，生殖嵴表面上皮细胞增殖形成初级性索，随后有丝分裂且数目激增，初级性索退化，在性腺上皮形成次级性索。次级性索分离成多个独立细胞团，称之为原始卵泡[1]。当生殖细胞不再分裂增殖且大量退化消失时，仅有一小部分卵原细胞生长并分化为初级卵母细胞，且全部进入第一次减数分裂，并停留在双线期，称为减数第一次分裂中期(metaphase Ⅰ，MⅠ)阻滞。MⅠ阻滞的卵母细胞被一层颗粒细胞包围，随着卵泡发育经窦前卵泡形成生长卵泡，被卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)筛选出的优势卵泡在促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)峰来临时，介导一系列分子使促成熟因子(maturation promoting factor，MPF)激活从而恢复减数分裂，形成成熟卵泡。随后卵母细胞完成第一次减数分裂，于排卵前停留在第二次减数分裂中期，受精后完成第二次减数分裂[2]。在这整个过程中涉及到的多种生物学现象，例如分裂前期的物质储备以及随后的检查点停滞等，都为卵母细胞正常发育及成熟提供了必要条件。这些复杂的生物学现象受到雌性动物激素以及各种细胞因子及通路的精细调控，转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)通路是调控细胞生长的经典通路，并被医学界广泛研究[3]。研究证明，TGF-β超家族的配体以及受体在多种动物卵泡中表达并存在受体表达特异性[4]。TGF-β超家族至少有35个成员，这些蛋白在身体里广泛分布，作为细胞外配体参与出生前后的多种生理过程[5]。在多数细胞中，它可以下调转录激活因子c-myc的表达而抑制细胞的生长使其停滞在G1期[6]。此外，它也促进MMP1、CXCR4、Snail和Slug等基因的表达而增加细胞的转移侵入能力。在卵母细胞发育中，TGF-β超家族参与卵母细胞发育的早期阶段，调控激素受体、颗粒细胞扩散和卵母细胞成熟等相关基因的表达[7]。TGF-β通路包括配体、受体、细胞内信号传递蛋白和转录因子。配体结合受体形成复合物，激活受体丝氨酸/苏氨酸激酶，经下游Smad因子传递相应信号并由转录因子调节卵母细胞发育相关基因的表达。其作用包括休眠原始卵泡的激活、颗粒细胞和膜细胞的增殖及凋亡、类固醇形成、促性腺激素受体表达、卵母细胞的成熟、排卵、黄体化和黄体形成等[8]。已有研究表明，TGF-β超家族成员可促进颗粒细胞扩散，进而阻断颗粒细胞与卵母细胞之间的通道连接，降低卵母细胞中的环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)含量，从而促进卵母细胞打破阻滞发育成熟。不仅如此，卵母细胞周围的环境也直接或间接通过TGF-β通路调节相关基因的表达，从而调控卵母细胞发育[9]。本文从TGF-β通路对卵母细胞的直接影响和间接影响方面就该通路在哺乳动物卵母细胞发育中的关键作用进行阐述。

1　TGF-β/Smad通路

TGF-β超家族作为一个庞大的蛋白因子库，在多种细胞中含量可观，在卵泡发育过程中起到相当重要的作用。卵泡液中包含大量的TGF-β超家族配体成员，其受体也在卵泡多种细胞表面表达，接受内分泌与旁分泌因子，传递信号以调节多种目的基因的表达。Smad 蛋白是TGF-β受体激酶的底物，直接接受膜受体信号，并传递至胞核中[10]。信号通路的下游是与目的基因表达相关的转录因子，调控关键基因的表达从而发挥通路作用。

1.1　配体

TGF-β超家族因子有相似的序列和结构特点，他们通过6个保守的半胱氨酸残基发挥作用[11]，根据他们激活下游特异的Smad分子而将其分为2个亚家族TGF-β/Activin/Nodal和BMP/GDF/MIS。TGF-β/Activin/Nodal亚家族激活下游Smad2/3通路，作用于诱导细胞外基质合成，网织红细胞分化，背部中胚层形成和促卵泡激素的释放，以及抑制有丝分裂。BMP/GDF/MIS亚家族激活下游Smad1/5/8通路，可参与诱导腹侧中胚层形成、软骨和骨的形成以及细胞凋亡等作用。尽管TGF-β配体对细胞产生的作用不尽相同，但它们结构特点相似，因此根据它们的生理作用将其划分为TGF-βs(TGF-β1-5)、骨形成蛋白(BMPs,BMP2-16)、GDFs(GDF1-15)、激活素、抑制素。由于BMP1是一种金属蛋白质，将其归为虾红素家族[12]。

1.2　受体

在受体丝氨酸/苏氨酸家族包含12个成员，即7个Ⅰ型受体和5个Ⅱ型受体，它们在组成上都含有N端的细胞外配体结合位点，跨膜区和C端丝氨酸/苏氨酸激酶位点。Ⅰ型受体包含典型的SGSGSG结构，称之为GS结构域，Ⅱ型受体将Ⅰ型受体的GS结构域磷酸化从而使其激活，因此，有活性的受体信号复合体包括配体和与之结合的两种受体。一些受体的变体具有N末端或者C末端的延展，但是它们的具体功能还有待研究。而下游的直接受体R-Smads1、2、3、5和8是由它们的信号特异性来分组的[11]。Smads根据结构和功能被分为3种亚家族，其中5种受体激活型Smads(R-Smads)包括了Smad1、2、3、5和8，Smad6和7属于抑制型Smads(I-Smads)，仅Smad4属于通用Smad(So-Smads)。研究表明，Smad2和Smad3是卵巢发育和维持功能的重要因子[13]。

1.3　作用机制

TGF-β配体信号通过结合2种不同的丝氨酸-苏氨酸激酶受体(即Ⅰ型受体与Ⅱ型受体)来发挥作用[12]。配体受体结合有两种方式，例如骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)亚家族的一些成员先与Ⅰ型受体亲和，而后配体-Ⅰ型受体复合物再与Ⅱ型受体亲和；而与BMPs相比，TGF-βs 和激活素(Activin)则先与Ⅱ型受体结合，再与Ⅰ型受体合并形成一个大的配体受体复合物，包含1个配体二聚物和4个受体分子。随后，形成细胞内受体激酶结合位点，促进Ⅰ型受体磷酸化激活。不同的受体复合物激活不同的R-Smads，TGF-β亚家族主要激活Smad2和Smad3，BMP亚家族主要激活Smad1、5和8，而后再与Co-Smad即Smad4结合进入细胞核从而调控关键基因的表达。受体的激活受着严格的调控，例如，一些可溶性蛋白可阻止配体与受体的结合，起负调控作用。此外，关键调控基因BAMBI (BMP and activin receptor membrane bound inhibitor，BAMBI)由BMP操纵，其结构与Ⅰ型受体极其相似，可以作为伪受体与Ⅰ型受体竞争配体，但不引起下游SMADs的磷酸化，从而对TGF-β通路起到负调控作用，使BMP保持合适的作用浓度[11]。因此，在卵泡中TGF-β信号通路中，内部与外界环境调节受到各个环节的蛋白浓度影响，使其在卵母细胞成熟过程中发挥复杂而有序的作用。

2　TGF-β通路对卵母细胞发育的直接影响

卵泡作为卵母细胞生长发育的环境，为其提供必要的营养物质和生存条件，其中大部分因子来自于卵泡细胞的自分泌与旁分泌作用。究其成分发现卵泡液中一大类含量丰富作用广泛的物质来自于TGF-β超家族，如图1所示，它们由卵母细胞以及卵泡颗粒细胞分泌，在卵泡及卵母细胞发育的不同时期调控其发育成熟[14]。已有研究表明，骨形成蛋白15(bone morphogenetic protein 15，BMP15)以及GDF9(growth and differentiation factor 9，GDF9)可促进卵丘颗粒细胞扩散以及卵母细胞的减数分裂恢复，从而促进卵母细胞发育成熟[15]。

2.1　骨形成蛋白

哺乳动物卵巢组织中表达多种骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)，作为TGF-β超家族的主要成员之一，其在卵泡发育过程中起到关键作用。卵母细胞分泌的BMP-6、BMP-15和GDF-9，可以自分泌与旁分泌的形式发挥作用[16]，颗粒细胞分泌的BMP-2、BMP-5、BMP-6以及卵泡膜细胞分泌的BMP-2、BMP-4、BMP-7则通过旁分泌途径调控卵母细胞发育[17]。研究表明，体外成熟培养猪卵母细胞时，BMP-15、GDF-9的表达量在生发泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)时期增加，在MⅠ期达到峰值，而在MⅡ期下降，期间还显著增加卵母细胞成熟相关基因c-mos、Cyclin B1和cdc2以及颗粒细胞扩散相关基因Cas2、Ptgs2、Ptx3和Tnfaip6的表达，此外还增加了母源基因c-mos、Cyclin B1和cdc2的表达量，说明GDF-9和BMP-15参与猪卵母细胞体外成熟培养时期的颗粒细胞扩散,并刺激成熟相关因子和分裂蛋白激酶[18]。BMP-15和BMP-6具有调节颗粒细胞的分裂增殖、卵丘扩展及卵泡膜细胞分化，抑制颗粒细胞凋亡等功能，对维持卵巢内健康卵泡的发育有重要作用。GDF8是壁颗粒细胞生成的一种旁分泌因子，可以激活p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)通路,从而改变卵母细胞活性氧含量和成熟基因 Nrf2、Bcl-2以及颗粒细胞扩散相关基因PCNA、Nrf2、Has2、Ptx3和 TNFAIP6的表达，促进卵泡和卵母细胞的发育[19]。

图中显示了卵泡发育的不同时期所对应的卵母细胞发育进程以及TGF-β超家族成员对其发挥的调节作用

The figure shows the developmental stages of oocytes corresponding to different stages of follicular development and the regulatory role played by members of the TGF-β superfamily

图1TGF-β超家族对卵泡及卵母细胞发育的直接影响

Fig.1Direct effect of TGF-β superfamily on follicular and oocyte development

2.2　激活素

激活素主要由颗粒细胞分泌，是类似于抑制素及卵泡抑素的一种非甾体类激素。其Ⅰ型受体与Ⅱ型受体分别在颗粒细胞、卵母细胞及卵泡膜细胞上均有表达，激活素主要由颗粒细胞分泌，可以促进垂体合成并分泌FSH，增加颗粒细胞上FSH受体结合位点和芳香化酶活性的同时，促进雌激素E2的分泌。激活素以自分泌或旁分泌方式调控颗粒细胞增殖分化，促进卵母细胞成熟，提高卵泡发育能力，抑制卵泡闭锁，而卵泡抑素能抑制其作用[20]。

2.3　抑制素

抑制素主要由颗粒细胞分泌，是一种异二聚体糖蛋白，其作用与激活素相反，可以抑制脑垂体分泌FSH，降低雌激素E2的分泌，在卵泡发育过程中起到负调控作用。抑制素和卵泡抑素协同抑制FSH的分泌，而激活素则中和其作用[20]。当卵泡受到刺激时，抑制素B可通过对促性腺激素的应答反映卵泡生长。有研究表明，促性腺激素刺激后抑制素B的预测值可能降低，它是临床上超数排卵后的一个潜在生物标志物，但不能指示怀孕[21]。因此，抑制素作为卵泡卵母细胞发育的负向调节蛋白，与激活素共同调节卵母细胞的精细发育。

2.4　TGF-βs

TGF-βs是一类调节细胞发育和分化的多功能多肽细胞因子，主要是在卵巢内局部产生的，有5个亚型，哺乳动物只表达 TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，三者的生物学作用相似，可通过旁分泌、自分泌的形式发挥作用。已有研究表明，颗粒细胞和卵泡膜细胞均会分泌TGF-β1和TGF-β2[22]。其中TGFβ1是TGF-βs配体中最丰富的亚型，与卵泡发育、颗粒细胞的增殖、分化和排卵有关。TGF-β2位于卵泡膜细胞和黄体细胞中，它可以调节颗粒细胞和黄体细胞中抑制素和活化素的产生[23]。在猪颗粒细胞中TGF-β2可以抑制FSH诱导的cAMP应答元件结合蛋白的转录激活，从而调控卵母细胞的发育进程[24]。在TGF-βs的作用之下，卵泡细胞接受发育中信号得以正常增殖分化，卵母细胞减数分裂适时恢复。

2.5　抗苗勒管激素

抗苗勒管激素(AMH)是由颗粒细胞分泌，作为负调控因子以旁分泌与自分泌的形式作用于颗粒细胞，维持卵母细胞的MⅠ期阻滞，并抑制原始卵泡向生长卵泡发育。AMH可作为衡量雌性动物卵巢功能的指标，其血清含量与卵泡质量密切相关，可反映卵巢的储备功能，因此，近几年来AMH成为再生医学研究的热点。AMH在雌性动物性成熟后开始分泌，贯穿整个生育期，可以抑制卵泡的招募，随着年龄的增长而分泌减少。试验证明，血清中MHA含量与卵巢储备量成正比[25]。在超数排卵试验中AMH水平逐渐降低，此外，血清AMH水平与超数排卵后时间呈正相关，但与临床妊娠无关[21]。 因此，AMH作为生育能力和卵巢发育状况的指标，为临床医学提供了很好的分子标记。

3　TGF-β通路对卵母细胞的间接影响

除了直接作用于卵母细胞，TGF-β通路还可以通过颗粒细胞以及偶联其他信号通路对卵母细胞发挥间接调节的作用(图2)。体外成熟培养试验表明，在卵母细胞结构和胚胎形成时期，多种蛋白的相互作用是关键[26]。因此，不同的蛋白途径与TGF-β通路的作用相交织，使卵母细胞受到复杂而精确的调控。卵母细胞外的颗粒细胞保护卵母细胞不被损伤，其分泌的细胞因子通过卵泡或者缝隙连接与卵母细胞进行信息交流，激活下游的丝裂原激动蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和MPF等促进卵母细胞减数分裂的关键调节分子，与TGF-β超家族偶联而促进卵母细胞成熟。但TGF-β通路与MAPK、MPF之间是如何建立的相互联系还有待研究[18]。Smad2、AKT和MAPK P38的激活可能参与卵母细胞MⅠ中期向MⅡ中期转化。Smad2、AKT和JNK1磷酸化与孕激素分泌呈正相关，与卵丘细胞凋亡呈负相关，这些参与者可以通过周围的颗粒细胞来调节不同阶段的卵母细胞减数分裂成熟[27]。

3.1　偶联环腺苷酸途径

cAMP在哺乳动物卵母细胞发育过程中控制着卵母细胞的减数分裂恢复，而TGF-β超家族成员通过改变cAMP的产量而调节卵母细胞成熟。未成熟卵母细胞MⅠ期阻滞主要靠维持低活性MPF，细胞周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)和细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)分别为其催化亚单位和调节亚单位，然而CDK1灭活和细胞周期蛋白B1的恒定降解在MⅠ期阻滞时使MPF活性降低[28]。卵母细胞中高水平的cAMP是负责预防CDK1激活和维持卵母细胞MⅠ阻滞的关键[29]。当LH峰到来之前，通道蛋白打开，颗粒细胞中的环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)进入卵母细胞中抑制cAMP磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)活性，使卵母细胞内保持高浓度的cAMP。此外，cAMP依赖蛋白激酶(protein kinase A，PKA)与一些MPF调节组分(例如，合成细胞周期蛋白B或MEK / MAPK信号级联)的相互作用也有利于维持MⅠ期阻滞。而当LH峰到来时，卵泡液中的LH 作用于颗粒细胞表面的LH受体，使通道蛋白关闭，cAMP很快被水解，CDK1被激活从而恢复卵母细胞的减数分裂[30]。LH介导的信号转导致使大量分子激活CDK1，活性CDK1不仅在减数分裂恢复期间磷酸化不同的减数分裂磷酸蛋白，而且通过抑制CDK1拮抗蛋白磷酸酶(PPs)的活性来抑制其快速去磷酸化[31]，因此，MPF活性升高，减数分裂阻滞恢复。

3.2　偶联激素途径

哺乳动物的每个发情周期都有数个到数十个卵泡生长发育，而最终选择个别优势卵泡成熟排卵。在卵泡液中，许多TGF-β超家族成员直接参与颗粒细胞增殖和类固醇调控，影响成熟促进因子(MPF)、细胞抑制因子(CSF)与其他信号的级联，使卵母细胞周期受激素刺激调控。例如，生长分化因子9(GDF9)促进颗粒细胞扩散的同时也抑制孕酮生成[32]。虽然卵泡雌激素主要涉及维持前期阻滞，但成熟类固醇和膜孕激素受体参与卵母细胞中减数分裂G2～M1进程[31]。在卵泡募集过程中，对FSH反应最强的被选为优势卵泡，此时颗粒细胞开始在FSH影响下表达LH受体，窦状卵泡雌二醇(E2)产生增加，同时抑制垂体释放FSH，因此FSH和LH协同支持卵泡发育。随着优势卵泡发育，颗粒细胞逐渐扩散，期间需要促卵泡激素(FSH)和表皮生长因子(EGF)的活动以及卵母细胞分泌的卵丘扩张启动因子(CEEF)，例如BMP15和GDF9[33]。很多试验证明BMPs是黄素化的抑制剂，也是调节孕酮生成的关键因子，能提高颗粒细胞对FSH的反应性，从而促进雌二醇产生的同时抑制黄体酮生成。雌激素可以促进卵泡发育及排卵，也诱导颗粒细胞的增殖同时抑制其凋亡。此外，GDF9诱导透明质酸合酶2(Has2)、环氧合酶2(COX2)、穿透素3(Ptx3)、前列腺素(Ptgs2)和卵丘细胞中gremlin(GREM1)基因的表达，促进颗粒细胞扩散。BMP15刺激细胞增殖，并调节类固醇激素的表达，在卵母细胞成熟后发生卵丘细胞扩张的时刻，BMP15表达有峰值。BMP15与GDF9相互作用，调整颗粒细胞扩散中基因的表达[34]。因此，TGF-β超家族因子不仅参与到卵母细胞的发育调节，还通过相关激素途径影响了卵母细胞的生存环境以及关键的调节信号，共同促进卵泡及卵母细胞的成熟。然而TGF-β通路对激素更加精细的调控机理还有待进一步试验研究。

3.3　偶联EGF途径

体外试验表明，小鼠卵母细胞培养液中添加表皮生长因子(EGF)和TGF-β因子可以促进卵母细胞的成熟以及后期的胚胎发育[35]。在排卵前LH通过EGFR的信号传导刺激卵泡中EGF家族中双调蛋白，外调蛋白和β细胞素的产生，其引发的EGF样因子足以诱导卵丘扩张以及卵母细胞成熟并促进排卵[15]。在卵泡的发育过程中，卵母细胞分泌的生长分化因子9(GDF9)激活下游Smad2/3，使FSH/EGF通过MAPK通路发挥作用。EGF 直接促进了GDF9作用的TGF-β通路，从而影响了颗粒细胞扩散基因的表达以及卵母细胞的成熟，该通路依靠EGF受体以及MAPK3/1的磷酸化，不受Alk4/5/7受体分支的影响而独立发挥作用。EGF受体依赖的MAPK3/1磷酸化是颗粒和卵丘细胞中GDF9发挥功能所必需的。因此，除了其在排卵LH信号传递中的作用之外，EGF样因子可以作为GDF9作用于颗粒细胞的关键调节剂[36]。进一步观察结果表明，卵丘细胞中EGFR信号的激活与cAMP刺激的途径一起触发卵母细胞成熟和卵丘扩张。来自卵母细胞的EGF样配体可以通过EGFR的激活磷酸化卵泡细胞中的MAPK，并关闭周围颗粒细胞和卵母细胞之间的缝隙连接通道，导致卵母细胞中cAMP水平的下降而诱发排卵。此外，EGF还能通过抑制颗粒细胞凋亡而促进卵母细胞的成熟质量[37]。EGF对卵母细胞的调控复杂而有序，不同的通路之间各自独立而又相互交织成网。大量的研究表明它们在卵母细胞及胚胎发育中起关键作用，但关于TGF-β通路与EGF在卵母细胞发育中的相互作用仍不清楚。

图中显示了TGF-β通路与EGF通路以及cAMP作用相偶联的机制。箭头表示对下游的促进作用，横线表示对下游的抑制作用，虚线表示有待进一步实验证明

The figure shows the mechanism by which the TGF-β pathway is coupled to the EGF pathway as well as the cAMP action.The arrow indicates the promotion effect to the downstream and the horizontal line indicates the inhibition to the downstream.Dotted line indicates the effect unknown

图2TGF-β通路偶联EGF途径以及环腺苷酸途径对卵母细胞成熟的影响

Fig.2Effect of TGF-β pathway coupled with EGF pathway and cyclic adenosine monophosphate pathway on oocyte maturation

4　小结与展望

TGF-β通路偶联激素途径调控FSH含量以及颗粒细胞对FSH的反应，从而影响LH受体激增引起的EGFR通路和环核苷酸通路的激活，参与了哺乳动物的排卵前事件。BMPs通过促进颗粒细胞扩散以及卵母细胞成熟相关基因的表达促进成熟，但其抑制FSH诱导的类固醇激素生成。而激活素在诱导FSH生成方面与卵泡抑素和抑制素形成反向调控环节，共同维持FSH的适宜含量。AMH与MPF共同维持MⅠ阻滞，保证后续发育卵泡的质量。当卵母细胞减数分裂恢复，卵泡开始发育时，LH作为卵母细胞发育中的关键激素，感知FSH的变化而激活各个通路，精准地调控卵泡发育过程中减数分裂的恢复，从而保证卵母细胞正常发育成熟。由于LH受体不表达于卵母细胞表面，因此由颗粒细胞产生的LH引起缝隙连接蛋白开放，影响cAMP途径从而启动卵母细胞的减数分裂恢复，促进其发育成熟(图2)。

卵母细胞作为雌性生殖细胞直接影响动物的繁殖效率和质量，因此，对其成熟的影响因素也将成为科学界关注的热点。研究发现的外泌体作为特异性分泌的膜泡参与细胞间通讯，对卵母细胞成熟发挥举足轻重的作用[38]。总之，不论是卵母细胞内在的还是外界的因素，它们组成一个共同的网络有条不紊地调控着卵母细胞的发育。为了更加明确卵母细胞成熟过程中的调控机制，还需要对不同通路的不同因子进行更深入的研究，从而为临床工作提供指导，而这项研究也会为人类精准生殖医学做出巨大贡献。