Hsp90AA1识别狂犬病病毒磷蛋白截短体及磷酸化位点突变体的研究

许运斌，孙玉章，刘　娟，颜　焰，高兴红，罗　果，王　欢

(1.遵义医学院贵州省普通高等学校传染病与生物安全特色重点实验室，贵州遵义 563000；2.青岛蔚蓝生物股份有限公司/国家动物用保健品工程技术研究中心,山东青岛 266000；3.浙江大学农业部动物病毒学重点实验室，浙江杭州 310058)

狂犬病病毒(Rabies virus，RV)磷蛋白(phosphoprotein，P)是一种由297个氨基酸(aa)组成的磷酸化蛋白，它的磷酸化通过两种细胞蛋白激酶进行，其N端S63或S64位点的磷酸化由细胞内未被完全鉴定的RV蛋白激酶(Rabies virus protein kinase，RVPK)负责，该位点的磷酸化作用尚不清楚；蛋白激酶PKC(protein kinase C)则负责对其C端S162、S210和S271的3个位点进行磷酸化，有研究发现这3个位点的磷酸化与否可影响P蛋白的核质分布[1-2]。RV P蛋白全长是P 基因mRNA的主要产物，除此之外，P蛋白还有其他4种截短形式(P2：aa 20-297；P3：aa 53-297；P4：aa 69-297； P5：aa 83-297)[3]。P蛋白全长定位于细胞质，而缺失核输出信号序列(nuclear export sequence，NES)的P蛋白截短体P3则定位于核仁并与核仁蛋白发生相互作用，如此有利于RV感染的正常进行[1,4-6]。随后有研究采用病毒反向遗传操作技术发现RV P蛋白的不同截短体在RV神经侵染能力、复制能力以及拮抗干扰素能力等方面均发挥着重要的作用[7]。

热休克蛋白90AA1(heat shock protein 90AA1，Hsp90AA1)是真核细胞中表达量最为丰富和保守的一种重要的分子伴侣蛋白[8-9]。与其他众所周知的分子伴侣Hsp70和GroEL/ES蛋白不同的是，Hsp90并不参与大部分蛋白的初始折叠，而是有选择地促进其客户蛋白的最后成熟[10]。Hsp90的客户蛋白包括蛋白激酶、转录因子,如p53和甾体类激素受体(steroid hormone receptors，SHRs)以及各种病原体蛋白[11-14]。因此，Hsp90蛋白不仅在蛋白折叠中发挥着功能，而且在各种宿主细胞生理进程(包括信号转导、胞内运输和蛋白降解)和病毒感染中起着重要的作用。

最近,本实验室研究发现,Hsp90AA1通过与RV P蛋白相互作用使之处于稳定状态进而正调控RV的感染[15]，而Hsp90AA1是否能够识别RV P蛋白截短体及磷酸化位点突变体尚不清楚。本研究在真核表达情况下对Hsp90AA1与RV P蛋白截短体及其磷酸化位点突变体的相互作用进行免疫共沉淀分析，以获得对RV P蛋白截短体及其磷酸化位点突变体在RV感染过程中作用方式的新认识，有助于解析RV复杂的复制机理，为狂犬病的有效防控提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1细胞培养鼠神经瘤母细胞(Mouse neuroblastoma N2a cells，N2a)培养于含50 mL/L胎牛血清的DMEM培养基。N2a细胞铺至6孔板，待细胞密度培养至80%左右时进行相关质粒转染，转染24 h后换液继续培养，在转染48 h后收获细胞总蛋白样品。

1.1.2抗体Flag标签鼠单抗，Sigma公司产品；Myc标签兔多抗，杭州华安生物技术有限公司产品；GFP标签鼠单抗，Abcam公司产品；HRP标记的羊抗鼠IgG和HRP标记的羊抗兔IgG，KPL公司产品。

1.1.3主要试剂PCMV-N-Myc、PCMV-N-Flag和PEGFP-C3，Clotech公司产品；Ex FectTM转染试剂，Vazyme公司产品。含1×苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)的Western及IP裂解液，上海碧云天生物技术有限公司产品；Protein A/G，Santa Cruz Biotechnology公司产品。

1.2　方法

1.2.1真核表达载体构建及其转染小鼠全长的Hsp90AA1基因通过PCR从N2a细胞cDNA中获得，然后克隆至PCMV-N-Myc。全长的P蛋白基因通过PCR从RV毒株HEP-Flury cDNA中获得，然后分别克隆至PCMV-N-Flag和PEGFP-C3，分别命名为Flag-P和GFP-P。根据RV P蛋白在宿主细胞内的截短形式，通过PCR从RV毒株HEP-Flury cDNA中获得P2、P3、P4和P5多种截短形式的基因片段，然后克隆至PCMV-N-Flag，分别命名为Flag-P2、Flag-P3、Flag-P4和Flag-P5。根据RV P蛋白磷酸化位点的具体位置，在PEGFP-C3-P载体的基础上构建S64、S162、S210和S271单一位点或所有位点突变(S→A)的真核表达载体，分别命名为GFP-P、GFP-P64、GFP-P162、GFP-P210、GFP-P271和GFP-P多突(所有位点突变体)。真核表达载体的转染采用ExFectTM转染试剂，具体操作步骤参考该转染试剂说明书。相关载体构建的特异性引物见表1。

表1　载体构建引物序列

1.2.2免疫共沉淀转染后的细胞首先用预冷的1×磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)缓冲液漂洗2次，之后采用含1×苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)的Western及IP裂解液于4℃过夜进行裂解。裂解后的细胞蛋白样品4℃、12 000 r/min离心10 min,去除非溶解的细胞碎片。离心后的蛋白上清部分采用Protein A/G琼脂糖珠于4℃预处理30 min。之后5 000 r/min离心3 min,去除预处理用的琼脂糖珠。预处理后的蛋白上清部分与IP用的抗体于4℃过夜进行孵育。接着加入新鲜的Protein A/G 琼脂糖珠于4℃孵育6 h。之后采用离心和1×PBS缓冲液洗涤法收集Protein A/G琼脂糖珠。琼脂糖珠上结合的蛋白复合物通过加入SDS 4×蛋白上样缓冲液煮沸洗脱。最后洗脱后的蛋白用于免疫印迹分析。

2　结果

2.1　Hsp90AA1与RV P蛋白多种截短体的相互作用

采用Flag-P、Flag-P2、Flag-P3、Flag-P4和Flag-P5和Myc-Hsp90AA1共6种真核表达质粒进行以下试验。Myc-Hsp90AA1与Flag-P、Flag-P2、Flag-P3、Flag-P4或Flag-P5共转染于293T细胞之后，采用Flag鼠单抗进行免疫共沉淀；被沉淀出来的免疫复合物采用Flag鼠单抗和Myc兔多抗进行免疫印迹分析。结果显示，Hsp90AA1能够与RV P蛋白的多种截短体发生相互作用(图1)。由此可知，Hsp90AA1能够广泛识别RV P蛋白各种截短体，对于该蛋白各种截短体的稳定可能都起着重要作用。

2.2　Hsp90AA1与RV P蛋白多种磷酸化位点突变体的相互作用

采用GFP-P、GFP-P64、GFP-P162、GFP-P210、GFP-P271和GFP-P多突和Myc-Hsp90AA1六种真核表达质粒进行以下试验。Myc-Hsp90AA1与GFP-P、GFP-P64、GFP-P162、GFP-P210、GFP-P271或GFP-P多突共转染于293T细胞之后，采用GFP鼠单抗进行免疫共沉淀；被沉淀出来的免疫复合物采用GFP鼠单抗和Myc兔多抗进行免疫印迹分析。结果显示，Hsp90AA1能够与RV P蛋白的不同磷酸化位点突变体发生相互作用(图2)。由此指示，Hsp90AA1也可广泛识别RV P蛋白的不同磷酸化位点突变体，对于不同RV P蛋白磷酸化位点突变体的稳定也可能都起着重要作用。

A.免疫共沉淀分析Hsp90AA1与RV P蛋白多种截短突变体的相互作用；B.对A中的Myc和Flag融合蛋白水平采用Image J软件进行相对定量分析

A.Immunoprecipitation analysis of the interaction between Hsp90AA1 and truncated mutants of Rabies virus phosphoprotein;B.Comparative quantitative analysis of Myc and Flag fusion proteins described in A using Image J software

图1Hsp90AA1与RV P蛋白多种截短体相互作用的分析

Fig.1Analysis of the interaction between Hsp90AA1 and truncated mutants of Rabies virus phosphoprotein

3　讨论

狂犬病病毒是一种单股负链不分节段的RNA囊膜病毒，其基因组长度为11 928 nt～11 932 nt。该病毒基因组可编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依赖的RNA聚合酶(L)等5种结构蛋白。其中P蛋白作为聚合酶L蛋白无催化活性的辅助因子，在RV RNA合成中起着重要的作用。该蛋白与N蛋白和RV基因组形成蛋白核酸复合物，进而调节L蛋白参与病毒的转录与复制。P蛋白也能够与许多宿主细胞蛋白相互作用，进而经不同方式执行利于病毒复制的功能。有研究表明，P蛋白与动力轻链8蛋白(dynein light chain 8，LC8)的相互作用对于RV的致病性相当重要，而且P蛋白中LC8的结合区域可有效地促进病毒的转录[16-18]。P蛋白作为干扰素拮抗因子与激活的STAT相关蛋白相互作用可对抗JAK-STAT信号通路的激活[19-20]。此外，P蛋白能够阻断IRF3的磷酸化进而抑制干扰素的产生[21]。有研究发现黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)能够通过与P蛋白相互作用正调控RV的复制[22]。近期研究发现,不同截短形式的RV P蛋白通过其干扰素拮抗活性促进肌肉细胞中的病毒复制，从而支持病毒对外周神经的感染[7]。本实验室在之前的研究中证明了Hsp90AA1能够通过稳定P蛋白进而正调控RV的复制。而本研究发现Hsp90AA1能够广泛识别天然存在的不同截短形式的RV P蛋白。由此暗示，Hsp90AA1可能通过相互作用来稳定P蛋白不同截短体，然后经不同途径发挥正调控RV复制的作用，这有待更为深入的研究。

A.免疫共沉淀分析Hsp90AA1与RV P蛋白多种磷酸化突变体的相互作用；B.对A中的Myc和GFP融合蛋白水平采用Image J软件进行相对定量分析

A.Immunoprecipitation analysis of the interaction between Hsp90AA1 and phosphorylated mutants of Rabies virus phosphoprotein;B.Comparative quantitative analysis of Myc and GFP fusion proteins described in A using Image J software

图2Hsp90AA1与RV P蛋白多种磷酸化位点突变体相互作用的分析

Fig.2Analysis of the interaction between Hsp90AA1 and phosphorylated mutants of Rabies virus phosphoprotein

RV P蛋白的磷酸化位点主要有N端的S63或S64位点，以及C端的S162、S210和S271位点[23]。RV不同毒株P蛋白N端区域磷酸化位点不尽相同，这些位点的磷酸化对于该蛋白的二聚化没有影响，其功能还有许多不确定性[24]。P蛋白C端区域的磷酸化，尤其是S210位点的磷酸化似乎可调控P蛋白的核质分布，在阻断细胞先天性免疫反应方面起着重要的作用[1]。本研究发现P蛋白不同位点磷酸化突变体均能与Hsp90AA1发生相互作用，但不同磷酸化位点突变之后(S→A)与Hsp90AA1相互作用的能力在减弱。其中的原由可能是磷酸化位点的磷酸化与否,对于P蛋白空间构象的形成至关重要，而Hsp90AA1作为伴侣蛋白对不同空间构象的P蛋白识别能力有差别。

总而言之，本研究通过构建RV P蛋白不同截短形式和不同磷酸化位点突变形式的真核表达载体，经免疫共沉淀初步证明Hsp90AA1能够广泛识别其截短体及磷酸化位点突变体。这些发现有助于解析RV P蛋白不同截短体和磷酸化位点突变体的功能乃至病毒的复制机制，为狂犬病有效防控奠定基础。