双合汤对膝骨性关节炎大鼠关节液中PGE2、MDA、SOD及MMP-3的影响

杨康栋，李发炘，梁延昌，陈延锋，林志豪，赵晓勤*

(1.广州中医药大学，广东广州 510006；2.广州体育学院，广东广州 510500)

骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种软骨退行性病变和继发骨质增生为主要表现的慢性、进展性、退行性关节病变，主要累及软骨、滑膜、关节囊等结构[1]，其中以膝骨性关节炎的发病率最高，占所有骨性关节炎的50%。流行病学调查研究显示，我国骨性关节炎的患病率高达15%，60岁以上达50%[2-3]。目前膝骨性关节炎治疗手段众多，仅能减缓症状，未能从根本上改变膝骨性关节炎的病理生理进程[4]，究其原因是膝骨性关节炎的发病机制尚不明确[5]。有研究指出，前列腺素(prostaglandin，PG)E2、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、基质金属蛋白酶3(matrix metallo proteinase 3,MMP-3)等活性因子在膝骨性关节炎的发生发展过程中起到重要的作用[6-7]。中医药治疗膝骨性关节炎具有独特的优势，可以改善症状，提高生活质量，减缓病程[8-9]。但是其作用机制尚不明确。因此，本试验建立了膝骨性关节炎大鼠模型，用双合汤进行干预，观察其对关节活动范围、关节滑膜厚度和关节液中PGE2、MDA、SOD、MMP-3表达的影响，探讨其防治膝骨性关节炎的可能机制。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验动物和饲料SD健康雄性大鼠80只，SPF级，9周龄，体重190 g±10 g,基础饲料,均由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK(粤)2013—0002。

1.1.2药品双合汤(当归15 g，川芎15 g，白芍20 g，生地黄15 g，陈皮6 g，法半夏15 g，茯苓15 g，桃仁15 g，红花10 g，白芥子10 g，甘草6 g，桑寄生15 g，杜仲15 g)，由广东康美药业股份有限公司提供，每味中药单独包装，经营许可证号为粤AA2001217。将上述中药饮片加8倍量的水浸泡30 min后，煎煮40 min，取药液过滤另存，再加6倍量的水煎煮40 min后取液过滤，将2次药液混合，置于100℃环境浓缩至1 mL，相当于原药6 g，置于冰箱保存；盐酸氨基葡萄糖片，四川绿叶制药股份有限公司产品，规格：240 mg/片，42片/盒，国药准字H20060802，批号2016090。

1.1.3试剂和仪器大鼠关节液PGE2、MDA、SOD、MMP-3酶联免疫试剂盒，美国R&D Systems公司产品，购自上海通蔚实业有限公司；上海恒平AE523C电子分析天平，购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；TGL16D冷冻离心机，购自湖南迈达仪器有限公司；日立荧光分光光度计F-2700，购自广州市仪德科学仪器有限公司；水合氯醛，扬州市奥鑫助剂厂产品；902-ULTS超低温冰箱，美国Thermo公司产品。

1.2　方法

1.2.1造模方法和分组所有大鼠在造模前置于室温(24℃±2℃)、湿度(50%±5%)条件下给予基础饲料适应性喂养1周，待其代谢状态稳定后随机分为假手术组(20只)、模型组(60只)，每6只分笼喂养。参照Panicker S等[10]制备大鼠膝骨性关节炎模型：腹腔水合氯醛麻醉下于双膝关节腔内注射浓度为40 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，每2天1次，共注射2周。假手术组双膝关节腔注射等量的生理盐水。造模期间所有大鼠均自由进食基础饲料和蒸馏水。2周后若大鼠膝关节评分大于4分为建模成功[11]。2周后，假手术组20只全部存活，模型组死亡1只，2只未达KOA模型的标准，予以剔除，剩下57只随机分为模型组(n=19)、氨基葡萄糖组(n=19)和双合汤组(n=19)。

1.2.2给药方法参照人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表，氨基葡萄糖组给予盐酸氨基葡萄糖剂量为每日86.4 mg/kg，加生理盐水配成22 mg/mL的浓度灌胃；双合汤组给予每日12 g/kg双合汤灌胃，每天灌胃1次；假手术组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃，给药周期为4周。

1.2.3指标检测分别在2周和6周各取一半的大鼠进行检测。100 mg/mL水合氯醛溶液(3 mL/kg)经腹腔注射麻醉，于外膝眼处向关节腔内注入0.5 mL生理盐水后，反复活动关节后抽取关节液，3 000 r/min离心20 min后取上清液，置-70℃保存。ELISA法测定关节液PGE2、MDA、SOD、MMP-3的水平。

1.2.4大鼠关节后动度麻醉状态下，用相等的力伸展后回缩大鼠膝关节，用量角器测量其伸展至回缩的角度[12]。

1.2.5关节滑膜厚度处死大鼠，打开关节腔后刮取关节面上的滑膜组织，用螺旋测微器测定关节滑膜厚[12]。

2　结果

2.1　各组大鼠关节活动范围、关节滑膜厚度检测结果

造模2周后，模型组、氨基葡萄糖组和双合汤组大鼠的关节活动范围低于假手术组，关节滑膜厚度明显高于假手术组，差异显著(P<0.05)；药物干预4周后，跟假手术组相比，模型组关节活动范围继续降低，关节滑膜厚度继续增加，差异显著(P<0.05)；与模型组比较，双合汤组大鼠关节活动范围明显升高，关节滑膜厚度明显降低，差异显著(P<0.05)(表1)。

2.2　各组大鼠关节液MDA、SOD的检测结果

造模2周后，模型组、氨基葡萄糖组和双合汤组大鼠的关节液各组大鼠关节液MDA水平明显高于假手术组，SOD水平明显降低，差异显著(P<0.05)；药物干预4周后，与对照组相比，模型组大鼠关节液MDA水平继续增加，SOD水平继续下降，差异显著(P<0.05)；与模型组比较，双合汤组大鼠关节液MDA水平明显降低，SOD水平明显升高，差异显著(P<0.05)(表2)。

2.3　各组大鼠关节液PGE2、MMP-3的检测结果

造模2周后，模型组、氨基葡萄糖组和双合汤组大鼠的关节液PGE2、MMP-3水平明显高于假手术组，差异显著(P<0.05)；药物干预4周后，与对照组相比，模型组大鼠关节液PGE2、MMP-3水平继续增加，差异显著(P<0.05)；跟模型组比较，双合汤组大鼠关节液PGE2、MMP-3水平明显降低，差异显著(P<0.05)(表3)。

表1　各组大鼠关节活动范围和关节滑膜厚度的检测结果

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，ΔP<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

表2　各组大鼠关节液MDA和SOD的检测结果

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，ΔP<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

3　讨论

膝骨性关节炎是骨科常见病和多发病之一，临床主要表现为关节僵硬、活动受限等。随着老龄化进程的加速，膝骨性关节炎的发病率和患病率呈现明显上升的趋势。目前临床上治疗膝骨性关节炎的手段较多，但是因为不能减缓膝骨性关节炎的病理生理学进程，因而临床效果受到一定的限制。中医药治疗本病可以改善膝关节功能，提高生活质量，应用越来越广泛，但是关于其作用机制尚不明确。

表3　各组大鼠关节液PGE2和MMP-3的检测结果

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，ΔP<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

大量研究表明，包括氧自由基、金属基质蛋白酶、前列腺素E2等多种活性因子在膝骨性关节病的发生发展过程中起到非常重要的作用，各种活性因子间的综合作用诱导膝骨性关节炎的发生发展。氧自由基参与膝骨性关节炎的病理进程，氧自由基可以抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞死亡，抑制基质蛋白多糖和胶原的形成，降低自由基的含量，从而促进关节软骨破坏[13]。而MDA是氧自由基的代表物质，MDA可以反应机体氧自由基的水平。SOD为氧自由基清除剂，可以防止氧自由基对软骨细胞和细胞基质的破坏，保护细胞，防止膝骨性关节炎的进程，当关节炎较为剧烈，SOD大量消耗。MDA和SOD可以反应膝骨性关节炎的病情和疗效。PGE2是一种炎症介质，可以导致软骨吸收障碍，抑制蛋白多糖形成，影响骨代谢，从而介导骨性关节炎[14-15]。同时PGE2还可以促进IL-1对软骨的降解。MMP-3由成纤维细胞产生，可以促进细胞基质、细胞外基底膜和软骨胶原的降解，是骨性关节炎的重要标志物[16]。

关于膝骨性关节炎大鼠模型建立的方法主要有切断膝关节炎前交叉韧带、木瓜蛋白酶注射法、卵巢切除法等。由于关节腔内注射木瓜蛋白酶法具有复制成功率高、稳定可靠等优势，是目前实验研究中最常见的模型建立方法。本试验采用关节腔内注射木瓜蛋白酶法建立膝骨性关节炎大鼠模型，结果提示，造模2周后模型组大鼠关节活动范围明显减少，关节滑膜厚度明显增加，关节液PGE2、MDA、MMP-3水平明显增加，SOD水平明显降低，提示膝骨性关节炎大鼠模型复制成功。表明本试验中采用关节腔内注射木瓜蛋白酶法建立膝骨性关节炎的大鼠模型是切实可行的，模型的成功建立为后续干预提供了基础。

膝骨性关节炎属于中医学“痹病”范畴，中医学认为本病为本虚标实之病，本虚为肝肾亏虚，标实为风寒湿、血瘀痹阻筋络，肝肾亏虚贯穿疾病的始终，风寒湿、血瘀是重要的病理产物，也是重要的中心环节。双合汤养血活血，健脾化痰。方中当归活血养血，川芎、桃仁、红花活血化瘀，桑寄生、杜仲补肾壮腰强骨，生地、白芍养阴生津，陈皮、法半夏、白芥子燥湿化痰，茯苓、甘草健脾化湿。诸药合用，共奏养血活血，健脾化痰之功效。本试验发现，造模成功后膝骨性关节炎大鼠给予药物灌胃4周后，双合汤组大鼠关节活动范围增加，关节滑膜厚度降低，关节液中PGE2、MDA、MMP-3水平明显降低，SOD水平明显升高。表明双合汤可以降低膝骨性关节炎大鼠关节液PGE2、MDA、MMP-3的水平，升高SOD水平，改善膝关节功能，发挥治疗膝骨性关节炎的作用。

综上所述，双合汤治疗膝骨性关节炎是有效的，可以改善膝关节功能，可能与其抑制关节液中PGE2、MDA、MMP-3的表达和促进SOD的表达有关。