甘薯叶提取物中酚类物质测定及在冷却肉保鲜中的应用

徐洪宇，詹壮壮，高永悦，张京京，董瑶，崔浩

（1.吉林化工学院生物与食品工程学院，吉林吉林 132022）

（2.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林 132022）

冷却肉是指严格执行兽医检疫制度屠宰后的畜禽胴体迅速进行冷却处理，使胴体温度（以后腿肉中心为测量点）在24 h内降为0～4 ℃，并在后续加工、流通和销售过程中始终保持0～4 ℃范围内的生鲜肉，它比冷冻肉具有更佳的口感与营养。在正常储存条件下，肉类的腐败主要是由微生物大量繁殖和氧化作用引起[1～4]。通过在冷却肉上喷洒具有抑菌活性和抗氧化活性的物质，可以起到良好的保鲜作用，从而延长货架期，类似的研究结果也证实了这一观点。Kim 等[5]将含有原花青素的可食性薄膜应用到冷却肉上，研究结果表明，可食性薄膜能抑制微生物繁殖和脂质氧化，从而提高存储期内冷却肉的质量和延长保质期。研究者将富含虾青素的雨生红球藻提取物，喷洒在冷却肉上，可以起到很好的保鲜作用[6]。黑胡椒精油应用到猪肉保鲜上也取得了类似的保鲜效果[7]。

甘薯（Ipomoea batatasL.），是世界第七大粮食作物，也是我国主要的粮食作物之一。甘薯的块根和叶均可食用。目前主要利用甘薯嫩叶和柄烹饪菜肴、经粗加工制成甘薯叶茶，以及制作甘薯叶浓缩蛋白粉等[8]。但大部分茎叶被作为废弃物丢弃，造成资源浪费和环境污染，而甘薯叶中活性成分在很大程度上被忽略。文献报道，甘薯中含有丰富的酚类物质[9～11]。这些酚类物质除具有抗氧化活性和抑菌活性外，还具有抗诱变、抗癌、抗糖尿病、抗炎及抗病毒活性，具有促进人体健康的生理和药理功效[12]。

本研究以甘薯叶为原料，对甘薯叶粗提物的不同极性组分群（石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相）中酚类物质含量、抗氧化及抑菌活性进行测定；并将活性强的组分群应用到冷却肉保鲜上；同时利用超高效液相色谱-二极管阵列检测器/电喷雾飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography-diode array detector/electrospray ionization-time of fight-mass spectrometry，UPLC-DAD/ESI-TOF-MS）鉴别活性强的组分群中酚类成分。本研究旨在为甘薯叶的开发利用和深加工提供一定的理论参考和科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘薯叶粉：品种为浙薯75，叶片于2016年10月中旬采自河南省新乡市原阳县。叶片采集后在90 ℃下杀青处理20 min，在60 ℃干燥箱中烘干，粉碎，过20目筛备用。

猪肉：新鲜猪肉购买于吉林市西红柿超市，当天宰杀。菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均由吉林化工学院生物工程实验室提供。

1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2,2-二氮-双（3-乙基并噻唑-6-磺酸）铵盐（ABTS）、Folin-Ciocalteu试剂购自美国Sigma公司；没食子酸标准品，中国药品生物制品检定所；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、1,1,3,3-四乙氧基丙烷氯化铁、过硫酸钾等均为分析纯。

1.2 仪器设备

XS105DU型分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；FW100型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；UPLC-Triple-TOF/MS系统：AcquityTMultra型高效液相色谱仪，美国Waters公司；Triple TOF 5600+型飞行时间质谱（配有电喷雾离子源），美国AB SCIEX公司；Eppendorf minispan离心机，德国Eppendorf公司；PP-25型pH计，美国赛多利斯公司；HS-1300-U型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；YXQ-LS-30Sll型立式压力蒸汽灭菌锅，天津市泰斯特仪器有限公司；SPX250B型生化培养箱，上海福玛实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取物的制备

称取甘薯叶粉500 g，加入80%的乙醇（料液比1:20，m/V），在60 ℃下提取3次，每次12 h，合并提取滤液，45 ℃旋转薄膜蒸发浓缩，得甘薯叶粗提物浸膏。浸膏用500 mL蒸馏水溶解成悬浮液，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5～8次，将各萃取（余）相分别浓缩、干燥，得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，并将各相配制成所需浓度，用于总酚含量及活性测定。

1.3.2 总酚含量的测定

参考Turkmen等[13]的方法并略做改动。精确吸取40 μL样品，加入0.5 mL 0.1 mol/L Folin-Ciocalteu试剂混匀，静置5 min后加入7.5%（m/V）碳酸钠溶液0.5 mL，室温下避光反应2 h，725 nm下测定吸光值。以没食子酸（0.1～5.0 mg/mL）作为标品。根据标准曲线计算总酚含量，以每克干样品中含有的没食子酸毫克数计，单位为mg/g。

1.3.3 抗氧化活性测定

1.3.3.1 还原力测定

还原力的测定，采用Oyaizu[14]的方法。取1 mL不同浓度的粗提液，加入2.5 mL pH 6.6磷酸缓冲液，加入3 mL 1%铁氰化钾，50 ℃水浴10 min，冷却，加入2.5 mL 10% TCA，振荡摇匀，于3000 r/min，离心10 min。移取上清液2.5 mL，加2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁，室温下避光反应20 min，于700 nm处测定吸光值。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率的测定

DPPH自由基清除率的测定，采用Brandwilliams等[15]的方法，略作修改。取1 mL不同浓度的粗提液，加入3 mL 0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液，混匀后加入4.0 mL乙醇溶液，于室温下避光反应30 min后，517 nm下测定吸光度，以蒸馏水代替粗提液作为空白对照。按以下公式计算样品对DPPH自由基的清除率。

注：式中Ac为空白样品的吸光值，As为加入不同浓度样品后的吸光值。

1.3.3.3 ABTS自由基清除率的测定

ABTS自由基清除率的测定，采用 Re等[16]的方法，并作适当修改。将7 mmol/L的ABTS溶液10 mL，与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液10 mL混合，于室温、阴暗条件下放置14～16 h，使用前用0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4）将其稀释至吸光度为 0.72～1.2，即得到ABTS自由基工作液，现配现用。

取不同浓度的粗提液各1 mL，加入ABTS自由基工作液4 mL，反应6 min后在波长734 nm处，测吸光度，用蒸馏水代替粗提液做空白试验。按以下公式计算样品对ABTS自由基的清除率。

注：式中Ac为空白样品的吸光值，As为加入不同浓度样品后的吸光值。

1.3.4 抑菌活性测定

采用抑菌圈法进行测定[17]。将平板培养皿底以“十”字形划分成4等份，每一等分都标明代码。在超净工作台上用灭菌的移液管吸取0.1 mL的菌悬液于平板培养基上，并用刮铲将菌悬液均匀涂布。将浸过样品（100 mg/mL）的干燥滤纸片（直径为6 mm）按一定的顺序放置于含菌平板培养基上，置于37 ℃下培养24 h，培养好后用直尺量取抑菌圈直径，试验重复三次。

1.3.5 猪肉保鲜试验

1.3.5.1 肉样处理

在洁净消毒的案板上将冷鲜猪里脊肉除去筋膜后，平均分成5组质量为25±1 g的肉块，分别用配制0.5%、1%的乙酸乙酯相、0.5%苯甲酸钠和灭菌蒸馏水浸泡10 min，用保鲜膜密封，放入4 ℃冰箱中冷藏。在冷藏的0、3、6和9 d测定肉样的pH值、硫代巴比妥酸反应物值（TBARS）、肌红蛋白（MetMb%）含量、挥发性盐基氮（TVB-N）及菌落总数，每组重复3次。

1.3.5.2 pH值的测定

参照GB/T 9695.5-2008《肉与肉制品pH值测定》进行测定。

1.3.5.3 TBARS的测定

取10 g肉样，用研钵研碎加入10 mL 20% TCA搅拌10 min常温静置1 h，3000 r/min离心10 min。移取上清液2 mL加入0.02 mol/L TBA 2 mL，沸水浴30 min，冷却，在532 nm处测量吸光度，标准曲线计算TBA反应性物质（TBARS）值，并表示为mg、丙二醛（MDA）/kg样品。

1.3.5.4 MetMb%含量测定

参照Krzywicki[18]方法，加以改进。取5 g搅碎的肉样置于50 mL已加有5 mL冰冷的磷酸缓冲液（pH值为6.8，40 mmol）的聚乙烯离心管中，在4 ℃，1000 r/min冷冻离心15 min，过滤上清液，测量700、572、525 nm的吸光值。MetMb百分含量按下式计算：

1.3.5.5 TVB-N的测定

参考GB/T 5009.44-2003方法进行测定。

1.3.5.6 菌落数的测定

参照GB 4789.2-94方法进行测定。结果以对数log cfu/g表示。

1.3.6 UPLC-DAD/ESI-TOF-MS分析条件

色谱柱为安捷伦 ZORBAX-SBC18(100 mm×2.1 mm i.d., 3.5 µm)；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以0.1%甲酸乙腈为流动相B，线性梯度洗脱，0 min 5%B；2 min 5%B；15 min 30%B；25 min 50%B；33 min 95%B，流速为0.8 mL/min；柱温为35 ℃；检测波长为254 nm；进样量：5 µL。

质谱分析条件为，采用 UPLC-Triple-TOF 5600+飞行时间液质联用仪：正负离子扫描模式；扫描范围：m/z100～1500；雾化气：55 psi；气帘气：35 psi；离子源温度：600 ℃（正）550 ℃（负）；离子源电压：5500 V（正）～4500 V（负）；一级扫描：去簇电压：100 V；聚焦电压：10 V；

二级扫描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为20、40和60 V，进样前，用 CDS泵做质量轴校正，须使质量轴误差要小于2×10-6。

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 不同极性组分群中酚类物质含量及其抗氧化活性

图1 总酚含量及抗氧化活性Fig.1 Total phenolic content and antioxidant activity

甘薯叶粗提物的各萃取（余）相中酚类物质含量及抗氧化活性（还原力、DPPH自由基清除率及ABTS自由基清除率），如图1a～d所示，乙酸乙酯相中酚类物质含量（232.5 mg/g）极显著高于正丁醇相（57.4 mg/g）和石油醚相（45.3 mg/g），而水相的酚类物质含量（19.6 mg/g）显著低于其它相，可见甘薯叶粗提物中所含的酚类物质极性差异较大，酚类物质种类较多，且主要集中于乙酸乙酯相中。质量浓度为0.1～1.0 mg/mL时，各萃取（余）相的还原力、DPPH自由基清除率及ABTS自由基清除率均以乙酸乙酯相最强，其次为正丁醇相。

2.2 不同极性组分群抑菌活性

甘薯叶粗提物的各萃取（余）相：石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相，在100 mg/mL浓度下对大肠杆菌、金黄色葡萄菌的抑菌效果，其抑菌活性以抑菌圈直径大小衡量，如表1所示，4个极性组分群中，乙酸乙酯相的抑菌效果（11.8 mm、12.4 mm）强于正丁醇相（9.3 mm、10.3 mm）、石油醚相（8.6 mm、8.2 mm）及水相（8.3 mm、7.8 mm）。可见，甘薯叶中具于抑制大肠杆菌及金黄色葡萄球菌生长的活性成分，主要集中在中等极性组分群的乙酸乙酯相中。

表1 不同极性组分群的抑菌圈直径Table 1 Inhibition zone diameters of various polar group extracts in leaves

2.3 乙酸乙酯相对冷却肉保鲜的研究

甘薯叶粗提物的乙酸乙酯相具有较强的抗氧化及抑菌活性，以0.5%、1%乙酸乙酯相及0.5%苯甲酸钠浸泡冷却肉后，观察在存储期内，冷却肉各项指标的变化。

2.3.1 不同处理对贮存期内冷却肉pH值的影响

pH值是判定肉品新鲜度的重要指标之一。文献报道，新鲜肉浸出液的pH值在6.2以内，当肉腐败时，微生物和酶分解肉中的蛋白质，产生一系列胺和氨类的碱性物质，使肉的浸出液慢慢趋于碱性，也是2.3.4中挥发性盐基氮（TVB-N）值上升的原因[19]。由图2可知，在0～9 d内，不同处理组pH值均呈上升趋势，其中空白组上升趋势最快，0.5%乙酸乙酯相处理组次之，1%乙酸乙酯相与 0.5%苯甲酸钠处理组较慢。在第6 d时空白组的pH值超出了新鲜肉6.2的范围，在第9 d 1%乙酸乙酯相处理组pH低于0.5%苯甲酸钠处理组，且两种处理组肉样的pH值均保持在新鲜肉的标准。0.5%和1%乙酸乙酯相，能减缓肉样pH值升高，这一规律与原花青素处理肉样后实验结果相似[5,20]。黄师荣等[21]将九头芥梅干菜粗提物的乙酸乙酯相浸泡冷却肉后，在一定的贮存期内，与空白组相比，冷却肉pH值增长速率较慢，与本实验有类似结论。

图2 不同处理组的冷却肉在贮藏期间pH值的变化Fig.2 Changes of pH value of pork meat with different treatment groups during storage

2.3.2 不同处理对贮存期内冷却肉TBARS值的影响

图3 不同处理组冷却肉在贮藏期间TBARS值的变化Fig.3 Changes of TBARS value of pork meat with different treatment groups during storage

脂质氧化降低肉的营养价值，以及肉制品的基本感官特性，导致风味，质地和颜色等改变[22]。TBARS值越大，表明在存储过程中与此相关脂质氧化产物的积累程度越强[23]。Kim等[24]报道，在4 ℃下保存7 d，TBARS值范围在0.13～0.68 mg MDA/kg。

不同处理组冷却肉在冷藏期间的TBARS值变化如图3所示，在0～9 d，随着贮藏时间的延长，各处理组的TBARS值变总体上升，即随着贮藏时间的延长，冷却肉的脂肪氧化程度不断加强；1%乙酸乙酯相处理组与0.5%苯甲酸钠处理组TBARS值上升缓慢且数值接近，冷却肉经过 1%乙酸乙酯相处理后能够缓解脂质氧化的程度。研究者发现，肉样经抗氧化剂处理后，其脂质氧化程度呈剂量依赖性抑制[25,26]，本实验结果与此结论一致。

2.3.3 不同处理对贮存期内冷却肉中MetMb%的影响

图4 不同处理组冷却肉在贮藏期间MetMb%值的变化Fig.4 Changes of MetMb% value of pork meat with different treatment groups during storage

屠宰后胴体颜色变化主要是由肌红蛋白的变化引起，高铁肌红蛋白（MetMb）是肌红蛋白氧化后的产物，呈现棕褐色，是鲜肉在储藏过程中出现的一种不良现象。MetMb%可以作为评价鲜肉颜色的客观指标之一[27]。由图 4所示，空白对照组在 4 ℃条件下，MetMb%随时间延长均有较大的增加，其增加速度为空白组＞0.5%乙酸乙酯相处理组＞0.5%苯甲酸钠处理组＞1%乙酸乙酯相处理组，实验结果与 Zhang等[7]将黑胡椒精油处理冷却肉后，其MetMb变化趋势一致。有研究报道，细菌中的假单胞菌属等能加速 MetMb的生成[28]。由此可知，因 1%乙酸乙酯相中含有丰富的酚类等具有抗氧化及抑菌活性物质，从而延缓肌红蛋白氧化成MetMb的速度。

2.3.4 不同处理对贮存期内冷却肉 TVB-N的影响

图5 不同处理组冷却肉在贮藏期间TVB-N值的变化Fig.5 Changes of TVB-N value of pork meat with different treatment groups during storage

TVB-N是评价鲜肉品质的重要指标之一。随着肉样腐败程度加深TVB-N值会随之增加。GB 2707-1994猪肉卫生标准规定：鲜肉TVB-N值≤20 mg/100 g。

图5所示，随着贮藏时间的延长，各处理组TVB-N值均呈上升趋势，1%乙酸乙酯相处理组TVB-N值显著低于空白对照组，空白对照组在第 6 d达到 15.1 mg/100 g，第9 d已达到22 mg/100 g左右，该值超过鲜肉的标准，而0.5%和1%乙酸乙酯相处理组及0.5%苯甲酸钠处理组的 TVB-N值第 9 d时均小于 20 mg/100 g，冷却肉维持在鲜肉范围内。Olafsdóttir等[29]研究报道，TVB-N值与腐败菌群之间有显著的相关性。可见，抑菌活性物质的加入，可以延缓肉样腐败程度。

2.3.5 不同处理对贮存期内冷却肉菌落总数的影响

图6 不同处理组冷却肉在贮藏期间菌落数的变化Fig.6 Changes of colony total of pork meat with different treatment groups during storage

一般规定，一级新鲜肉菌落总数的对数值（log cfu/g）＜4，次级新鲜肉菌落总数的对数值为4～6，而变质肉菌落总数的对数值＞6[19]。不同处理对贮存期内冷却肉菌落总数的影响，由图6所示，实验前新鲜肉样的菌落总数的对数值为3.5左右，贮藏一定时间后，不同处理组的菌落总数均有升高，空白对照组的菌落总数增加较大，在第6 d时肉样接近变质肉菌落总数的对数值上限6，而经过1%乙酸乙酯相处理的菌落总数，在储藏期增长缓慢，第9 d菌落总数的对数值与第0 d的值接近。酚类物质具有较强的抑菌活性[30]，1%乙酸乙酯相可以抑制微生物的生长，从而延长冷却肉的保质期。实验结果与Dai等[31]报道相似。

2.4 UPLC-DAD/ESI-TOF-MS分析

甘薯叶粗提物的乙酸乙酯相，抗氧化及抑菌活性测定均强于其它萃取（余）相，并将其应用在猪肉保鲜上，发现乙酸乙酯相中含有可以延长冷却肉储藏时间的活性成分，利用高分辨液质联用系统，在280 nm波长下紫外检测，根据母离子峰、碎片离子、保留时间及紫外光谱图等信息（图7），结合参考文献的报道，对其活性成分进行分析、鉴定。共检测出8种酚酸类化合物和1种黄酮类化合物（表2）。

图7 乙酸乙酯相基峰色谱图Fig.7 Chromatograms obtained by UPLC-DAD/ESI-TOF-MS analysis of ethyl acetate fraction at 280 nm

化合物 1出峰时间为 7.31 min，[M-H]－为353.0878，主要离子碎片为191.0560[奎宁酸-H]－，对照相关文献，鉴定为 1-CQA[9～11,32,33]。化合物 2出峰时间为8.43 min，[M-H]－为179.0341，通过比较一、二级质谱，根据二级质谱[M-CO2-H]－等碎片离子，结构中存甲氧基，化合物鉴定为咖啡酸。化合物3出峰时间为11.57 min，[M-H]－为463.0896，碎片离子中含有m/z301.0356、151.0034等碎片峰，则化合物3中含有槲皮素结构，[M-Glc-H]－对应的碎片离子m/z301.0356为失去1个质量分数为162（葡萄糖Glc）的中性碎片后生成的离子。Fabre等[34]表明，在黄酮苷类化合物的 MS/MS图谱中，同时存在高强度的301.0356（Y0－）和 300.0274（[Y0-H]－）碎片离子，则表明糖连接在3-OH位。因此，化合物鉴定为槲皮素-3-O-葡萄糖苷。化合物 4（12.28 min）、5（12.75 min）、6（13.33 min），母离子[M-H]－分别为 515.1191、515.1215、515.1209，分析MS/MS裂解图谱及查阅文献，它们为diCQA的同分异构体。主要存在以下离子碎片353.0879[咖啡酰奎宁酸-H]－、191.0559[奎宁酸-H]－、179.0345[咖啡酸-H]－、173.0452[奎宁酸-2H2O-H]－、135.0455[咖啡酸-CO2-H]－。通过与 3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA的匹对，化合物4、5、6分别鉴定为3,4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA。同理，化合物 7、9鉴定为三咖啡酰奎尼酸异构体Ⅰ、Ⅱ[9,35,36]。而化合物 8（15.00 min），[M-H]－为 529.1385，其主要碎片离子中含有m/z173.0455、193.0511、191.0561、155.0349，Gu等[37]认为化合物结构中，咖啡酰基与4-OH相连，阿魏酰基与3-OH相连，确定化合物8为3-咖啡酰-4-阿魏酰奎宁酸。

表2 UPLC-DAD/ESI-TOF-MS鉴定乙酸乙酯相中酚类物质Table 2 Identification of the phenolic components in ethyl acetate fraction by UPLC-DAD/ESI-TOF-MS

3 结论

本研究以甘薯叶为材料，对其粗提物的萃取（余）相进行总酚含量、抗氧化及抑菌活性测定，筛选出抗氧化及抑菌活性强的萃取（余）相，进行冷却肉保鲜的研究，得到如下结论：

（1）不同萃取（余）相均含有酚类物质，其中乙酸乙酯相中酚类物质含量极显著高于其它萃取（余）相，为232.5 mg/g。

（2）四个不同极性组分群中乙酸乙酯相的抗氧化活性最强，并在一定浓度范围内强于 BHT的抗氧化活性。

（3）通过比较抑菌圈的大小来判断各萃取（余）相对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性，其由强到弱为，乙酸乙酯相＞正丁醇相＞石油醚相＞水相。

（4）分析冷却肉在4 ℃贮藏0～9 d的过程中pH值、TBARS值、MetMb%含量、TVB-N及菌落总数的变化结果。试验得到，1%乙酸乙酯相可以抑制脂肪氧化程度和微生物的生长，延长冷却肉的保质期。

（5）通过UPLC-MS/MS技术，从甘薯叶乙酸乙酯相中鉴定出9个主要酚类化合物，包括1-CQA、咖啡酸、3,4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、三咖啡酰奎尼酸异构体Ⅰ、3-咖啡酰-4-阿魏酰奎宁酸、三咖啡酰奎尼酸异构体Ⅱ。